反相(C18AQ)快速色谱筒在样品脱盐中的应用

反相液相色谱(RPLC)是液相色谱中广泛应用的分离机制。RPLC已被用于分离许多化合物，从低分子量的有机酸(MW)到分子量高达150 kDa的蛋白质。然而，具有良好水溶性(即亲水性或极性)的分析物在传统的C18 RP色谱柱上保留力较差。在这种情况下，为了增强极性分析物与疏水固定相之间的相互作用，需要增加流动相中的水比，从而增加极性分析物的滞留量。分析物的极性越大，流动相中所需的水的比例就越高。当规则的烷基键反相柱，如十八烷基二甲基硅烷(ODS, C18)在纯水或高水流动相中长时间使用时，会出现问题，包括分析物保留时间的损失和分离结果的不可重复性。这种现象称为相崩[1]。对这一现象的经典解释是，与硅胶表面结合的C18固定相改变了高水流动相中碳链的空间排列，即从垂直于硅胶表面变为与硅胶表面平铺在同一平面上(如图1所示)。固定相空间排列的改变减少了它与分析物的相互作用，因此减少了分析物的保留时间，经常导致它不被保留。

图1。反相色谱中相坍塌的经典解释说明(转载自参考文献1)。图示长链烷基相(a)在水-甲醇混合物和(b)在100%水中的构型。
研究人员对相塌现象进行了深入的研究。实验证据的不断积累使许多研究者接受了另一种新的理论解释，即保留时间的损失实际上是由于固定相颗粒[2]的细孔中发生的“脱湿”。在新的理论解释(图2)中，在水相流动相和疏水固定相表面之间产生了很高的表面张力。因此，流动相很容易从疏水固定相的多孔空间中排出。在这种情况下，流动相不再停留在固定相颗粒的多孔空间中，因此固定相与分析物相互接触的机会也减少了，这反过来又导致了分析物的保留时间减少。实验证实，当C18色谱柱中的流动相突然从高比例的有机溶剂切换到100%的水溶剂时，柱中流动相的体积显著减小，而这种体积减小的幅度与分析物保留时间的损失密切相关[3,4]。
图2。说明反相色谱中孔隙脱湿的可能机制(参见参考文献1)。当固定相上的烷基链被100%的水流动相用压力适当溶剂化时，分析物被适当保留(a)。当停止流动以允许水从孔隙中排出时，随着流动恢复，孔隙仍然是脱湿的，分析物不能进入孔隙，很少或没有保留(b)。
根据Young-Laplace方程，干燥的疏水固定相表面需要非常高的压力来驱动水相溶剂进入表面包含的孔隙中。这个公式将入侵压力与水的表面张力和水与空气在吸附剂表面的接触角联系起来:
其中ΔP为将液体送入孔隙所需的侵入压力，γ为表面张力，d为有效孔径，θ为吸附剂表面水与空气的接触角。由于100%流动水相与疏水烷基键合硅胶孔隙的接触角大于90°，因此，上式中的θ小于90°，ΔP应为正数，即需要正压推动流动水相进入硅胶孔隙。在常规的液相色谱分离中，驱动水流动相进入硅胶孔的压力大于驱动流动相流过整个色谱柱所需的压力。因此，当分离突然停止时，硅胶孔内的压力大于硅胶孔外的压力，水流动相就会从疏水烷基键合硅胶孔中被挤压出来。当该柱不经特殊处理重复使用时，由于吸附剂孔隙的脱湿状态，吸附剂与分析物之间的相互作用将大大减少，导致分析物的保留时间显著损失。而当固定相表面亲水性增强时，100%水流动相与疏水烷基键合硅胶孔的接触角减小。当接触角小于90°，即θ大于90°时，ΔP应为负数。在此条件下，硅胶孔外压力大于硅胶孔内压力，流动相会自发进入硅胶孔内。这是吸附剂孔隙被湿润时的情况。
以上理论分析表明，对于常规C18色谱柱，可以对硅胶表面进行亲水改性，以提高高水流动相[5]的润湿性，包括
•无端盖短链烷基相;
•亲水的、极端封的和极增强的固定相;
•极性嵌入烷基相;
•长链烷基相;而且
•wide-pore-diameter阶段。
制备了预填充亲水性c18键合硅胶，在硅胶表面引入亲水性氰基(如图3所示)的闪速色谱筒。在高含水条件下，硅表面的烷基链可以充分延伸，避免了相崩/润湿性现象。这些改良的C18色谱柱被称为水溶液C18色谱柱，即C18AQ色谱柱(SepaFlash, Santai Technologies)，专为高水溶液洗脱条件设计，可以容忍100%水溶液系统。C18AQ色谱柱已广泛应用于有机酸、多肽、核苷和水溶性维生素等高极性化合物的分离纯化。

脱盐是C18AQ柱在闪蒸色谱纯化样品中的典型应用，即去除样品溶剂中的盐或缓冲组分，以方便后续研究使用脱盐后的样品。在这个应用中，一个高极性化合物被用作样品，并在C18AQ墨盒上纯化。除去原料样品中含盐水组分，用有机溶剂代替样品溶剂，便于后续的旋转蒸发，既节省了溶剂又节省了操作时间。

实验部分

样品信息
该样品是合成反应的最终产物，如图4所示。
图4。样品的合成反应公式。
如图4所示，原样品中除了目标产物外，还有多余的铵盐(四丁基氟化铵，MW 261)用于合成反应。样品应经过脱盐处理，以得到满足纯度要求的目标产品。在色谱分离技术中，一般采用基于分子筛分原理的凝胶过滤来淡化大分子样品，包括蛋白质、多肽、核酸等。然而，对于本文中分子量为252的目标产物，用凝胶过滤将目标分子与分子量非常接近的盐杂质区分开来几乎是不可能的任务。必须考虑其他分离模式。

用闪蒸色谱法纯化样品

采用闪蒸色谱系统(SepaBean机2)，按表1所示参数对样品进行纯化。

表1。闪蒸净化实验装置。
仪器SepaBean机2
Flash墨盒12g SepaFlash C18AQ墨盒(球形二氧化硅，20 - 45 μm, 100 Å，订单号:SW-5222-012-SP(AQ))
波长254 nm;220海里
流动相溶剂A:水
溶剂B:甲醇

流速15毫升/分钟
样品载量0.5 mL (100 mg)

梯度时间(CV)溶剂B (%)
0 0
20 0
21 100
30 100

结果与讨论

在这篇文章中使用的样本是极极性的，可溶于水。由于正相硅管的极性高，且在正相硅管上保持力强，因此正相分离是不可行的。在反相分离模式下，如果使用传统的C18 RP Flash墨盒，样品将从固定相中快速洗脱，因为在初始流动相中有机相比大于10%。此外，收集的馏分中仍存在一定量的盐杂质，导致脱盐效果不佳。因此，使用C18AQ滤筒对样品进行净化。
设置了快速色谱的阶跃梯度。为了确保MW与目标产品非常接近的盐杂质被完全去除，使用纯净水作为流动相冲洗墨盒约20柱容积(CV)。如图5所示，当以纯水为流动相时，样品完全保留在C18AQ墨盒上。接下来，将流动相中的甲醇直接增加到100%，并保持梯度10 CVs。目标产物从22.5 ~ 24 CVs洗脱。在收集的馏分中，用甲醇取代水样溶液。甲醇在后续步骤通过旋转蒸发很容易去除，为后续纯化样品的研究提供了方便。
图5。样品在C18AQ墨盒上的快速色谱图。
与线性梯度相比，使用阶跃梯度有以下优点:
•减少了样品净化的溶剂使用和运行时间。
•ø ø目标产物以尖峰洗脱，减少了收集组分的体积，从而促进了后续的旋转蒸发，并节省了时间。
•■收集的产品为易蒸发的甲醇，因此缩短了干燥时间。
综上所述，对于强极性或高亲水性的样品的纯化，SepaFlash C18AQ滤盒与Flash色谱系统(SepaBean机)相结合无疑是一种快速有效的解决方案。

参考文献

1.Przybyciel M，专业RE(2002)。反相液相色谱中的相坍塌。LCGC North Am. 20(6): 516-523。
2.专业再保险公司(2013)。十大HPLC和UHPLC柱神话。
LCGC North Am. 31(7): 522-537。
3.Bidlingmeyer BA, Broske AD(2004)。反相高效液相色谱中孔隙大小和固定相组成在防止水诱导的保留时间损失中的作用。色谱科学，42:100-106。
4.王晓燕，王晓燕(2002)。100%流动水相反相高效液相色谱柱的保留行为。LCGC North Am. 20(10): 964-972。
5.major RE, Przybyciel M(2002)。高水流动相中反相LC分离的色谱柱。LCGC北。
20(7): 584 - 593。