用固定相技术分析亚硝胺

亚硝胺具有剧毒，被怀疑是人类致癌物。在高剂量下，它已被证明是一种肝毒素，可导致几种动物的肝纤维化和癌症。由于亚硝胺的毒性，必须使用可靠的方法监测这些化合物。亚硝胺的分析在制药工业中尤为重要。已发表了亚硝胺分析方法概述[1]，以及关于使用超临界流体色谱[2]的更具体的报告。亚硝胺的测定在食品工业[3]和某些环境分析[4]中也很重要。在本报告中，提出了一种同时检测9种亚硝胺、制造过程中使用的两种溶剂和几种重要药物的高效液相色谱法。九种亚硝胺(NDMA, NMOR, NMEA, NPPYR, NDEA, NPIP, NDPA, NDBA, NDPHA)从其他感兴趣的药物化合物中分离出来。两种溶剂，DMF和DMA常用在沙坦药物的生产过程中。这些溶剂的残留量在原工艺和最终药品中检测都很重要。 Therefore, it would be useful to have a reliable protocol for the separation of all nine nitrosamines and the solvents DMF and DMA. As part of this study, two of the columns used were fabricated with a unique type of stationary phase based upon silica hydride as the support material [5,6]. In contrast to ordinary silica, the surface of silica hydride is nonpolar as opposed to polar due to silanols on silica-based stationary phases. This property is used to facilitate the separation of the nitrosamines and the possible presence of solvent residues.

实验/材料

亚硝胺参考标准由Chem Service, Inc (West Chester, PA, USA)提供。二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基乙酰胺(DMA)购自Oakwood Products, Inc (stilll, SC, USA)。甲酸(FA)来自EMD (Gibbstown, NJ, USA)。去离子水(DI H2O)和乙腈(ACN) (HPLC级)从Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO, USA)获得。
在甲醇稀释剂中以1.0 mg/ mL浓度制备亚硝胺混合物的原液。每个亚硝胺以1mg /mL的浓度制成溶液，以确定洗脱顺序。以1.0 mg/mL的浓度制备药物混合物。DMF和DMA溶剂溶液的浓度为10 μ L/mL。以1.0 mg/mL的浓度制备氯沙坦和代文样品。峰的缩写和化学名称:1 = NDMA, n -亚硝基二甲胺;2 = NMOR, n -亚硝基somoroline;3 = NMEA, n -亚硝基甲基乙胺;4 = NPYR, n -亚硝基吡咯烷;5 = NDEA, n -亚硝基二乙胺; 6 = NPIP, N-nitrosopiperidine; 7 = NDPA, N-nitrosodi-n-propylamine; 8 = NDBA, N-nitrosodi-n-butylamine; and 9 = NDPHA, N-nitrosodiphenylamine. DMF = dimethylformamide and DMA = dimethylacetamide.
HPLC数据是在惠普(Palo Alto, CA, USA) 1200 HPLC系统上获得的，该系统由自动进样器、脱气器、二元泵和可变波长检测器组成。该系统与Agilent Chemstation (Santa Clara, CA, USA)软件进行接口。方法1使用分析柱(4.6 mm x 150 mm)填充Cogent BDC18™固定相(MicroSolv Technology, Leland, NC)。粒径为4 μ m，孔径为100 Å。方法2采用4.6 mm x 150 mm的色谱柱，填充Cogent RP C18™固定相。(MicroSolv技术公司，利兰，NC，美国)。粒径为3µm，孔径为100 Å。方法3使用Cogent UDC柱(4.6 x 150 mm)，粒径为4µm，孔径为100 Å。所有方法的二元流动相溶剂为A:去离子水+ 0.1%甲酸，B:乙腈+ 0.1%甲酸。每个色谱柱都采用梯度程序，方法1用于Bidentate C18，方法2用于Cogent RP C18™，方法3用于UDC色谱柱。方法一:时间(分钟); %B: 0-1.5; 5: 1.5-15; 60:
15 - 19;60: 11日;5.方法二:时间(min.) %B: 0-1.5;5: 5 - 15;70: 15 - 19;70: 19- 20;5.方法三:时间(min.) %B: 0- 5,5;5 - 15, 80; 15-19, 80; 19-20, 5. For all methods the post time was 5 min, the flow rate 1.0 mL/min, the injection volume 1μL and detection in the UV at 220 and 254 nm. The current USP only includes an assay for 7 nitrosamines: NDMA, NDEA, NDIPA, NEIPA, NMBA, NMPA, and NDBA in selected sartans (Diovan and Losartan).

结果与讨论

使用Bidentate C18，可以在一种方法中有效分离代文，氯沙坦和所有九种亚硝胺杂质。(图1A.)使用254 nm进行检测。BDC18还能从两种潜在的溶剂杂质中溶解9种亚硝胺(图1B氯沙坦和代文在RP C18色谱柱上表现出优异的峰形，但从亚硝胺杂质中溶解的能力低于BDC18(图2A)。
与Bidentate C18相比，RP C18上的两个sartan也较少保留。DMF和DMA在Cogent RP C18色谱柱上的保留也较少，与BDC18相比，DMF和DMA也不能从一个样品组分中完全溶解。(图2)。还可以看到，NPYR和NMEA这两个组分在两个固定相上的洗脱顺序是颠倒的。另外还对Cogent UDC固定相进行了测定。该柱中的键合部分由胆固醇组成，其11碳链连接到二氧化硅氢化物表面。胆固醇作为一种纯化合物是一种液晶，即使与色谱支撑面[6]结合也能保持一些有序结构。因此，UDC柱除了具有基于分子形状的疏水相互作用辨别能力外，还具有一定的选择性。图3显示了在优化梯度下得到的色谱图。所有九个亚硝胺标准品都是分开的，就像两个C18固定相一样。UDC相提供了更好的NPYR和NMEA的分离比任何一个十八烷基柱，也显示了两个额外的化合物，存在于NDPH标准和一个在NMEA标准。 The differences between the results obtained by the two C18 phases is most likely due to the main distinguishing feature between the two columns, i.e. the particle surface. One is composed of Si-H groups while the other has Si-OH moieties on the surface. It appears that for the purpose of this analysis, the hydride surface on the BD C18 provides somewhat better selectivity than the silanol surface of the RP C18.
总之，每种方法都提供了杂质和沙坦药物的分离，并采用了质谱友好的流动相。Bidentate C18保留并分离所有9种亚硝胺，并从重要药物中提供足够的分辨率。Bidentate C18提供了更好的DMF和DMA溶剂峰分辨率。Cogent RP C18可以保留和分离这些化合物，但与Cogent Bidentate C18相比，NDBA和NDPHA(分别为亚硝基正丁胺和亚硝基二苯胺)的峰值效率下降。根据分析人员的需要，Bidentate C18方法可能更适合于含有大量杂质和潜在溶剂残留的测定，而Cogent RP C18和Cogent UDC方法可能更适合于含有一些感兴趣的亚硝胺杂质的萨拉坦药物测定。

参考文献

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3.李志强，王建军，陈晓霞，胡松松，龚铁石，鲜强，分子印迹-固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定水中亚硝胺，中国食品化学，2019,29(2):366 - 366。
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