氟氏扩散池对Luliconazole % 1乳膏体外释药效果的比较研究

皮肤是给药的重要途径。然而，局部应用的挑战是在皮肤阻止外来物质吸收的同时给患者提供给定的剂量。因此，药物的有效性根据从载体释放的活性成分和给药后皮肤的经皮吸收而有所不同。因此，分析药物活性成分经皮给药释放速率已成为半固态制剂的关键性能数据。尽管多年来一直存在于文献中，乳霜产品的Franz细胞扩散测试最近发展成为体外释放测试(IVRT)最常用的工具。在本文中，使用Teledyne Hanson的Phoenix手动扩散测试系统，对含有Luliconazole活性成分的Bilconazol 1%乳膏(Bilim Pharmaceuticals，土耳其)进行IVRT。在32ºC，搅拌速度600 rpm的PBS:乙醇受体培养基中观察6小时以上的药物释放速率。IVRT之后，采用高效液相色谱法对样品进行分析。根据EMA指南在参考产品之间进行统计比较。结果证实，试验品与参考品之间无统计学差异。 Validation studies also performed to evaluate the influence of the different parameters of the Franz diffusion cells.

据估计，到2025年，全球局部用药市场将达到1298亿美元，在2019年，它在应用路线[1]中拥有最高的市场份额。虽然在口服和注射途径方面被忽视，但半固体剂型，如软膏、乳膏、凝胶、糊状和乳剂，具有独特的优势，如避免代谢转变、患者依从性、易于使用和减少外部给药引起的副作用[2,3]。由于活性化合物在控制释放和剂量精度方面的挑战，在半固态剂型的配方中实现其独特的组成和要求可能是复杂的。这使得制药公司更加关注透皮给药系统。
半固体剂型需要在对照临床试验中全面证明其缓释。然而，这些试验的持续时间和成本使其不适合作为常规控制方法[4,5]。因此，为了保证在实验室的性能和检查配方的可行性，经常采用体外试验。
体外释放试验(IVRT)能够从半固态产品中获得活性成分的一致释放数据。欧洲药品管理局(EMA)关于外用产品质量和等效性的指南[6]和美国药典(USP)半固体药品-性能测试[7]提供了确定半固体剂型药物释放的程序。然而，皮肤的复杂性，配方和应用过程的变化会显著影响释放率，指南不能提供一个单一的程序来解决这种多样性。一般指南没有提供特定于产品的协议来证明等价性。
本文旨在介绍使用Teledyne Hanson的Phoenix Manual扩散测试系统对1% Bilconazol乳膏进行的IVRT研究(图1)。通过膜实现了充足的药物从样品通过膜的传输，并且对释放没有速率限制作用。对关键参数进行了评估，并用高效液相色谱法(HPLC)验证了所开发的IVRT方法。通过统计分析，在测试产品和参考产品之间进行了成功的IVRT比较，以证明EMA指南[6]中讨论的参数是正确的。虽然这样的验证研究已经存在，但这项研究可能会揭示各种新的应用。

图1。Teledyne Hanson的凤凰手动扩散测试系统。

材料与方法

2.1药品
Bilim制药公司(Gebze，土耳其)生产的含0.5%和2%浓度的Bilconazol乳膏、安慰剂和不同配方的乳膏(Luzu cream 1% (8116357, Valeant，美国)用作方法验证的参考产品。
图2。Luliconazole分子[8]。
2.2.IVRT系统
IVRT研究采用Phoenix DB - 6干热扩散系统(59-201-101,Hanson Research Cooperation, USA)，符合USP规格[7]。研究了商用纤维素酯膜(0.45 μ M, 10401606, A29437704, GE Healthcare)作为药物扩散的模态合成膜。受体培养基为含50% (v/v)乙醇的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。在整个实验过程中，系统保持在32±0.5°C，旋转搅拌速度为600 rpm。在膜上放置大约400毫克的半固体产品，然后开始测试。然后在6小时内每隔1小时使用注射器从细胞的受体室中提取样本。用加热过的原液感受器介质将取出的体积调整到采样臂上的填充标记。一组6个细胞在一次运行中一起运行，每次运行，两个产品与ABABAB形式进行比较，以进行无偏置比较[9]。
2.3 IVRT计算方法
对每个细胞，提取的Luliconazole样品在277 nm波长下用HPLC-UV (e2695, Alliance, Waters Corporation)进行分析。流动相在样品盘温度25°C，柱温30°C，比例为10:90，注入量为10µL的等容条件下使用。流动相A用0.79 g醋酸铵在1000 mL蒸馏水中制备，通过0.45 μ M过滤器过滤并脱气。乙腈脱气，作为流动相b。Luliconazole从Symmetry C18色谱柱(250x4.6 mm, 5µm色谱柱，Waters, USA)以1.5 mL/min的流速洗脱。考虑到细胞体积、校正因子和有效扩散面积，将以mg/mL为单位的浓度值换算为mg/cm2。对于每个细胞，确定每个采样时间的药物释放量，并根据Higuchi Eq(1)对√t绘制累计释放量(Higuchi, 1961)。
Q = k×√t (1)
在式(1)中，Q (mg/cm2)是单位面积的药物释放量，t(小时)是时间，k是斜率，是药物释放速率的度量。每次运行的6个斜率的平均值是对剂型药物释放率的测量。
2.4统计分析
IVRT方法根据EMA指南[6]的方法进行了6次试验。产品相似度检验采用方差分析和学生t检验进行统计学分析，p<0.10显著性水平。使用12个测试品和参考品样品来证明与指定[6]的等效性。接受的另一个参数是释放的活性物质累积量与时间图平方根的线性关系。
2.5验证参数
采用HPLC-UV法对1% Luliconazole乳膏进行了验证，验证参数包括特异性、选择性、线性度、范围、准确度、精密度限、鲁棒性、稳定性和系统适用性。当100%标准溶液的相对标准偏差超过2.0%或欧洲药典(EP)板计数低于2000时，也进行系统适宜性试验。
2.5.1.特异性
通过空白受体培养基和安慰剂乳膏进行IVRT研究，研究可能由受体培养基、膜或安慰剂引起的干扰峰。在每次运行中，培养基和安慰剂在luliconazole的保留时间必须没有干扰。
2.5.2.选择性
为确定luliconazole的释放率，对不同浓度的配方进行了释放率评价。将释放率作为药物浓度的函数绘制，以准确观察变化的比例关系，并报告为线性关系(R2≥0.90)。
2.5.3.线性
制备了工作浓度150%与LOQ之间6种不同浓度的药物测定标准溶液。线性回归分析的计算R2值经检验均大于0.995。
2.5.4.精度
为了IVRT样本的准确性，安慰剂乳膏中加入了LOQ浓度为50%、100%和200%的luliconazole，分为3个重复。回收率应在95%和105%以内。对于LOQ，结果偏差不应超过±20%。此外，RSD应低于5%。
2.5.5.Precision
为了检验该方法的精度，计算了坡度间的变化，并检验了6个运行间的RSD是否小于2%。在90%的置信水平内比较试验品和参比产品释放率的重复性。最后，对于中间精度，由不同的操作员在不同的日子对同一批次的两次不同运行的释放率进行RSD，确保不超过10.0%。
2.5.6.鲁棒性
对于色谱系统和IVRT系统，通过对方法参数进行轻微扰动的IVRT测试来测试不同的参数。测试了两种柱温变化(27ºC和33ºC)和两种流动相比(流动相A: B比为5:95和15:85)对色谱体系变化的影响。此外，还对IVRT系统进行了混合速率变化(540 rpm和660 rpm)和受体温度变化(30ºC和34ºC)。结果的偏差预计不会超过15%。

结果与讨论

研究了两种配方的释放特性和它们之间的差异。第一步，建立了卢莱克唑的HPLC-UV分析方法。所选膜为混合纤维素;对于商业可用性及其惰性，以及在尽可能小的扩散阻力下实现高渗透性，因为膜与配方之间没有物理或化学相互作用是至关重要的，这可能会影响IVRT结果[10]。
其中一个关键参数是确保没有气泡进入细胞。因此，实验开始前必须对介质进行脱气。此外，半固体产物被扩散到整个房间的膜上，以消除基于扩散的变化，因为膜被分配来保持产物与受体介质分离，同时使它们之间的扩散通信。
系统适宜性参数检查EP板计数和%100标准溶液的相对标准偏差。结果为7128,rsd为0.28%。
3.1验证参数
3.1.1.特异性
通过空白膜和安慰剂进行两次独立的IVRT研究，研究可能的干扰峰。在检测到的保留时间范围内检测其峰值纯度，并通过测试。
3.1.2.选择性
评价三种不同浓度的Luliconazole乳膏的IVRT结果，并绘制其释放速率与药物浓度的关系。线性度为0.918，符合EMA规范[6](图4)。

3.1.3.线性
配制了工作浓度20%、50%、70%、100%、120%和LOQ 6种不同浓度的药物测定标准溶液。线性回归分析的计算R2值为0.999,R2值大于0.995(图5)。

图5。6种不同浓度的线性回归曲线。
3.1.4.精度
准确性分析在容积瓶中进行，通过添加安慰剂的luliconazole乳膏并用培养基稀释。然后在烧瓶中分别加入工作浓度的50%、100%、200%和LOQ百分比。除LOQ浓度外，RSD均小于1%。LOQ的平均值为4.9%，在可接受标准范围内。
3.1.5.精度
为了观察不同HPLC注射剂之间的差异，我们连续分析了6次，RSD为0.23%，符合可接受标准。使用测试品和参考品的释放率来研究重复性。学生t检验和ANAVO统计分析用于产品相似性检验。90%置信区间的结果在EMA指南[6]规定的范围内，因此通过了检验(表1)。

表1。发布实验结果供参考和测试产品。
结果参考测验
R2 0.974 0.998
K(µg/cm2/h0.5) 423.67 377.07
t检验(α=0,10) 0.17
方差分析(α=0,10) 0.52

同时，对同一批次的两次不同运行的IVRT结果进行统计分析，发现其释放率相同，证明操作员之间没有差异(RSD, 0.0001%)。
3.1.6.鲁棒性
对于色谱体系的变化，分别在27ºC和33ºC下测试柱温变化。观察到33ºC的k值为377.65(µg/cm2/h0.5)， RSD下降0.15%;27ºC的k值为376.23(µg/cm2/h0.5)， RSD下降0.22%。流动相比是影响色谱体系变化的另一个参数。移动阶段A: B的比例改为5:95和15:85。与377.03(µg/cm2/h0.5) k值相比，两种情况下k值分别下降1.6%和0.39%。
对于IVRT系统的变化，首先在540 rpm和660 rpm下尝试混合速率。这些变化的变异率分别为6.25%和5.92%，同样低于15%的偏差率。温度升高2ºC时，受体的释放率提高48.2%，温度降低2ºC时，受体的释放率降低52.2%(表2)。这些结果证明，IVRT的混合速率、柱温和流动相变化不影响药物的数量，尽管IVRT的温度条件对释放率有显著影响，并应考虑作为一个关键参数[11]。

表2。计算不同参数和条件下IVRT结果(R2、释放率和%差异)。
系统参数条件R2 k %
柱温
&流动相比27ºC, 10:90 0.998 376.23 0.22
33ºc, 10:90 0.998 377.65 0.15
30ºc, 85:15 0.998 370.99 1.60
30ºc, 5:95 0.998 375.58 0.39
IVRT受体温度
&搅拌速率30ºC, 600转0.996 180.34 52.2
34ºC, 600rpm 0.994 558.77 48.2
32ºC, 540转0.999 353.51 6.25
32ºC, 660pm 0.999 399.41 5.92

4.结论

本报告对1% Luliconazole乳膏的IVRT方法的验证参数进行了综合研究。采用IVRT方法对参比产品与试验产品进行相似度比较。适当的惰性和市售的纤维素酯膜和PBS:乙醇受体培养基在32ºC和600转搅拌棒速度与扩散细胞系统一起使用。每小时用高压液相色谱法分析luliconazole在膜上的扩散情况。确定了对IVRT系统可能的影响，并确定了验证参数。局限性和接受标准根据EMA指南[6]制定。
研究发现，IVRT研究的关键参数是受体环境的温度。应考虑使用区域的温度，并监测任何可能的变化，以便释放速度不会造成高影响。本文所讨论的方法可用于其他相关的IVRT分析，以供进一步研究。

确认

这项工作得到了Bilim制药公司科学部下属的分析方法开发实验室研发部门的支持。
竞争利益声明
没有需要声明的冲突。

参考文献

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