干细胞技术的当前和未来创新

干细胞101

组成器官和组织的每种细胞类型都来自一种称为干细胞的更原始的细胞类型。干细胞是生物体的基础，具有独特的自我更新和分化为专业细胞类型的能力。有三种不同类型的干细胞，由它们可以产生的专门细胞类型的数量分类：i）多能干细胞（例如胚胎干细胞）可以生成任何专门的细胞类型；ii）多能干细胞（例如间充质干细胞）能够生成多种但不是全部的专门细胞类型；iii）一能细胞（例如，产生皮肤的表皮干细胞）仅产生一种细胞类型。长期以来，人们一直认为，干细胞仅在一个方向上分化为专用细胞类型。在干细胞生物学方面取得了许多令人兴奋的进步，最值得注意的是发现诱导的多能干细胞（IPSC），这些干细胞（IPSC）证明了一个成熟的分化专业细胞可以恢复为原始的多能干细胞（Takahashi K，2006）。这一发现改变了我们对干细胞生物学的理解，从而在干细胞工具，技术和应用中实现了令人兴奋和实质性的进步。本文着重于多能干细胞，因为它们提供了最有希望的未来应用。

在实验室中使用干细胞 - 过去和现在

为了利用干细胞的力量，必须首先维持体外组织培养。干细胞的培养膨胀是棘手的，因为它们必须保持在未分化状态，并且不允许在需要之前分化为其他细胞类型。简而言之，如果干细胞没有在对数相生长中分裂，则它们是区别的。从历史上看，众所周知，多能干细胞在实验室中很难处理，这主要是由于源自动物组织的试剂的固有变异性。

GMP：未来是关于过程弹性的

良好的制造实践（“ GMP”）是影响干细胞技术当前和未来创新的一个重要概念。这受到控制药物制造过程的药物调节机构（例如FDA）管理的正式法规。将干细胞用作治疗剂的使用已经需要专门的药物法规称为晚期治疗药物（ATMP）。与化学合成的药物不同，可以通过化学分析定义最终产品，ATMP是复杂的生物生物实体，整个制造过程都定义了最终产品。简而言之，在干细胞整个生命周期内触及干细胞过程中干细胞的每种试剂都成为最终产品的组成部分。因此，在“现实世界”中，即使该项目仍处于R＆D或临床前阶段，干细胞制造过程中使用的试剂的质量和一致性对于下游临床应用至关重要。一旦保留用于临床应用，GMP已成为影响干细胞研究和应用各个方面的主导概念。研究人员和临床开发人员受益于干细胞技术中以GMP为重点的创新，这些创新提供一致的生长特性和高质量的结果。

干细胞工作流程

在体外干细胞培养的各个方面都取得了克服过去挑战的重大进展。其中包括在组织培养基中的进步，细胞外基质，3D合成细胞培养塑料，生长因子，解离酶，冷冻保存剂和分化技术。体外培养干细胞的工作流程不是线性过程，而是一个可以分解为6个步骤的连续圆：1）组织培养塑料软件的细胞外基质涂层；2）组织培养瓶的复兴/播种；3）在孵化器中扩展细胞培养物；4）培养基变化；5）亚文化或“传播”一个烧瓶；6）干细胞培养的冷冻保存。干细胞工作流程如图1所示。

干细胞工作流的组件

细胞外基质

今天的培养干细胞的艺术比过去要容易得多。干细胞随着组织培养瓶或菜肴表面的粘附培养物而生长（图1所示，步骤3）。为了使干细胞粘附在表面上，必须用细胞外基质覆盖。在早期，这是一种努力维持培养物中的干细胞，因为培养物需要在成纤维细胞的“饲养层”上生长。第二个细胞培养与干细胞培养的需求艰苦地建立并严重限制了实验和应用（由于污染的成纤维细胞与干细胞混合在一起）。从小鼠肿瘤中分离出来的细胞外基质消除了对饲养层培养物的需求，但一致性可能是可变的，并且含有污染物。如今，研究人员受益于重组表达的细胞外基质，这些基质包含层粘连蛋白511片段，这些片段可提供多种细胞类型的高效粘附，并且易于使用（只需1小时的涂层时间即可节省时间和成本）。层粘连蛋白511片段可实现出色的多能干细胞依从性。重组细胞外基质层粘连蛋白511在哺乳动物细胞培养（例如CHO细胞）或昆虫培养物（例如蚕）中表达，这消除了细胞外基质中动物衍生产物的需求。另外，还可以提供合成3D塑料支架（例如Alvetex），可提供非生物学的刚性定义的矩阵。

培养基

早期的干细胞培养基需要每天补充培养基。这意味着在实验室中每周7天倾向于干细胞培养物。组织培养基组合物的优化使周末可以保持培养物，而无需中等变化，从而无需喂食器，无喂食者，无周末的干细胞培养。这听起来可能微不足道，但确实对使用干细胞的研究人员的生活方式产生了巨大影响。与早期的组织培养基不同，培养基的组成是充分定义的，没有动物衍生产品。除去动物来源的产品通过消除动物来源产品固有的可变性并保证细胞生长一致，从而提供了重要的优势。此外，无动物的配方阐明了动物产物引起的感染风险（例如TSE风险）。生长因子是将干细胞保持在未分化状态的培养基的关键组成部分。市场上可用的产品包含从大麦表达和隔离的增长因素。

亚文化

干细胞在培养血管中经历细胞分裂。随着它们的扩展，他们最终将超越自己的房屋，并必须进行亚文化以分开烧瓶以提供进一步增长的空间。常见的做法是使用消化酶从培养表面释放干细胞。从牛分离的胰蛋白酶在组织培养实验室中很普遍。今天可用的产品的进展使用玉米中表达的胰蛋白酶在溶液中稳定。胶原酶是一种替代解离试剂，在各种细胞上均温和，有效，并且可以使用无动物和GMP等级 - 再次实现了稳健的一致培养条件，并消除了对本质上可变的动物衍生产物的依赖。

冷冻保存

从培养物中收获的干细胞可以安全地储存并储存（或“冷冻保存”）数十年。如果需要，则可以在提供可再生的干细胞来源的培养物中对冷冻保存的干细胞进行解冻，恢复和扩展。在干细胞冷冻保存过程中，至关重要的是防止细胞死亡和基因型/表型的变化。当今的冷冻保存媒体可以在解冻后保持一致的高细胞活力。即使在长期储存后，也要维持细胞多能力，正常的核型和增殖。传统上，冷冻保存过程涉及速率控制的冰柜或专门的容器，以-1ºC/min的冻结细胞。冷冻保存剂的进步已经消除了对速率控制的冻结的需求。现在的过程很简单 - 您只需将干细胞悬架放入-80ºC冰箱中即可。此外，冷冻保存剂具有GMP级别，没有动物衍生的成分。

分化

干细胞的力量在于它们具有自我更新和分化为专业细胞类型的能力。分化的过程使干细胞从工作流程向应用的工作流程中去除。将干细胞分化为特定细胞类型的分化使应用数量的增加。典型的分化方案在数周内使用培养基，细胞因子，生长因子和细胞外基质的逐步变化，以将干细胞引导到特定的谱系和命运。如今，创新技术使用遗传重编程因子，这些因子迅速（<1周）将干细胞区分为成熟的细胞表型。这一进步大大减少了实验时间，并增加了分化细胞类型的制造能力。

表1.干细胞技术的进步。
描述创新产品创新示例的领域
细胞外基质重组层粘连蛋白在CHO和蚕imatrix-511中表达
培养基在周末不需要介质，GMP等级，无动物茎媒体
生长因子重组，GMP级，无动物的干purotein
解离试剂胰蛋白酶酶在玉米中重组表达。胶原酶和中性蛋白酶在梭状芽胞杆菌tryple中表达
胶原酶NB
中性蛋白酶NB
不需要冷冻保存率控制的冻结。GMP级，无动物，可用于临床使用。适用于所有细胞类型。STEM-CellBanker
分化通过遗传重编程快速骨骼肌肉的快速定向分化
快速内皮
Quick-Neuron

未来的技术和应用

疾病建模

有一些无限的应用是由可再生细胞类型的可再生来源引起的。使用分化干细胞的一个令人兴奋的创新领域是疾病建模。过去，研究器官或组织中的疾病状态仅限于使用体内动物模型。而分化的干细胞为在体外特定细胞类型中创建疾病状态的机会打开了机会。此外，当前的技术可以在实验室生成类器官或“迷你器官”。疾病特异性诱导的多能干细胞也可用于在体外创建疾病模型，这是研究疾病和药物发育的宝贵工具，而无需体内动物模型。从理论上讲，任何组织都可以在体外产生。在一个令人兴奋的干细胞疾病模型的例子中，日本京都的CIRA博士成功地模拟了类器官和未分化的多能干细胞中SARS-COV-2的生命周期（Takayama，2020年）（Sano，2021年）（2021年）（2021年）（（2021年）（图2）。在另一个例子中，使用骨骼肌分化试剂盒从干细胞中产生骨骼肌肌管以创建体外疾病模型（图3）。在直接应用中，骨骼肌的多能干细胞模型也已成功地用于开发针对杜钦肌营养不良的新型治疗方法（Moretti，2020年）。

在盘子里耕种肉

在实验室或通常称为“培养的肉”中创建肉的有希望的进展。环境问题正在推动对传统农业方法进行更可持续的肉类生产的需求。干细胞研究本身正在减少在此处突出的多个方面使用动物的需求。产生培养的肉在原则上是直接的，但实际上面临许多挑战，例如，维持培养细胞的正确环境和刺激，以产生具有正确的动物衍生产物的正确一致性和特征的肉类。干细胞培养物在生物反应器中扩展，并分化为骨骼肌细胞。这些可以使用可食用的支架进行结构化，也可以用作生产肉类产品的原材料（图4）。工具和技术很容易实现此目标：干细胞的扩展和分化非常有效。但是，关键的考虑是商品成本。当前的技术太昂贵了，但是这些是开创性的时期，研究的速度正在以令人兴奋的速度进行。

结论

STEM技术的希望和潜力只有在干细胞培养条件保持一致并且研究科学家和商业操作都可以达到生物学，医学和粮食生产才能实现。betway88体育官网干细胞工作流的多个方面的激动人心的进步已经简化了提供完全定义和无动物的产品。此外，由于符合GMP的试剂的可用性，干细胞疗法和药物发现的临床翻译也会加速。这些基础设定为从干细胞技术中出现的发现和应用的光明未来。

作者

William Hadlington-Booth博士是AMSBIO的干细胞技术和细胞外基质的业务部门经理。Erik Miljan博士是一系列退行性和疾病状况的细胞疗法发展的先驱。他拥有香港大学的生物化学博士学位。有关更多信息，请联系：
william@amsbio.com

参考

Moretti，A。F.等。（2020）。猪肌营养不良症的猪和人类模型中的体细胞基因编辑可以缓解骨骼和心肌衰竭。自然医学，26，207–214。
高桥K.等。（2006）。通过定义的因素从小鼠胚胎和成年成纤维细胞培养物中诱导多能干细胞。。细胞，126，663-676。
高山（2020）。SARS-COV-2研究的体外和动物模型。药理学趋势，41。513-517。
Sano，E。等。（2021）。用表达ACE2的人IPS细胞对SARS-COV-2感染进行建模及其个体差异。Iscience，24（5），102428。