通过液相色谱和高分辨率准确质量分离卡马西平的异构代谢物

关于废水中排出药物存在的环境问题已得到充分记录[1]，并引入了高分辨率质谱（HRMS），例如飞行时间和Orbitrap仪器，有助于其检测。尽管HRMS是一种高度特异性的技术，但可能会在复杂的矩阵中发生干扰。本文描述了使用Thermo Scientific Orbitrap Q Extive HRMS仪器[2]，分析了卡马西平（CBZ）及其代谢物的废水样品（CBZ）及其代谢物时如何克服一些遇到的问题[2]

CBZ是一种广泛规定的药物，用于治疗癫痫和神经性疼痛，众所周知，它是一种持续的环境污染物，在废水处理过程中未分解。
大多数药物在排泄之前是代谢，但是在废水中对这些代谢产物的检测才刚刚开始常规测试。CBZ主要以Trans-10,11-dihydro-10,11-二羟基甲状腺泽平（Trans-CBZDIOH）代谢物排泄，但也形成了甲氧化代谢物，卡马西平），甲状腺素氧化甲氧胺（CBZEP），这给人类和人类造成负面影响[3]和人类[3]和人类[3]和副作用在环境中有毒。还有五个CBZ的单羟基代谢物具有与CBZEP相同的前体离子质量相同的质量，并且因为它们在结构上都是相似的，在片段化时最高丰度中产生了相同的产物离子。Oxcarbazepine（OXCBZ）是CBZ的替代品，由于它不能代谢为有毒的CBZEP，但它也具有与CBZEP和单羟基代谢物相同的分子式。这使得即使使用HRMS也很难区分不同的代谢产物，并且需要仔细解释数据和良好的色谱法，以确保单羟基代谢物与CBZEP分离，并且不报告错误的高浓度。CBZ的另一种新药物替代品是Eslicarbazepine（Eslicbz），也包括在本研究中。
表1显示了本研究中包括的分析物的化学结构，前体离子和分子公式的摘要。
表1.本研究中的化学结构和前体离子。
用于该分析的质谱仪是一种热科学Q激活轨道质谱仪，该质谱仪配备了Dionex Ultimate 3000 RS泵，Dionex Ultimate 3000 RS AutoSampler（在10ºC下控制温度）和Dionex Ultimate 3000 RS色谱柱（30ºC的温度控制，）。
该软件是Chromeleon®，Xcalibur™和TraceFinder™。
电离是通过电离模式的电喷雾，喷雾电压为3.5 kV。护套和辅助气体分别为45和10个任意单位，毛细血管和辅助温度均为300ºC。完整的MSIM实验的范围为50 - 750 m/z，在目标MS2方法中指定目标离子，其隔离窗口为4 m/z。对于两个实验，质量分辨率均为35000。
色谱柱是Atlantis®DC18色谱柱150×2.1 mm，粒径为3 µm。
流动相A是甲醇，B在超石水中为0.1％甲酸。LC梯度以99％B的速度开始2分钟，然后在3分钟内升至70％B，并保持11分钟。B的组成在1分钟内降至1％，并在此保持3分钟。最终在1分钟内返回到99％B，然后重新平衡9分钟。流速为0.2 mL/分钟，注射体积为10μL。
首先将含有CBZ，CIS-CBZDIOH，TRANS-CBZDIOH，CBZEP，OXCBZ，ESLICBZ和CBZ-10 HYDOXYDIHYDRO分别注入1000 ng/mL的溶液，以确定每个分析物的保留时间。然后将它们注射为混合物。
在处理混合物时，在CBZ的237.11→194.0963的特定过渡时观察到三个峰（图1A）。这是一种合成的混合物，该溶液不应包含具有这种特定过渡或前体离子的任何其他药物，并且最初的特异性丧失是有关的。7.9分钟的干扰对应于Eslicbz和12.5分钟10,11-dihydro-10-10-羟基甲虫，分别为297.12→194.0963和255.11→194.0963。尽管它们具有相同的产物离子，但每个产品的前体离子对于每种离子都大不相同。
在9.5分钟时，CBZEP观察到类似的污染，这次干扰时间的保留时间为6.4和7.2分钟，对于顺式和反式CBZDIOH而言是一致的。

仔细检查表明，这可能是由于离子源中的碎裂所致。尽管电喷雾是一种软电离技术，但某些分析物可以在离子源中分解[4]。
进行了实验以确认额外的峰值是由于源自中的碎片。将Eslicbz的溶液直接以10 µL/min的流量直接注入离子源中。
将ESLICBZ溶液输注到离子源（图2A）（图2A）以M/z 297.1227，钠加合物M/z 319.1045和M/Z 237.1017与CBZ一致的M/Z 237.1017产生了Eslicbz的预期前体离子。在色谱过程中，Eslicbz从色谱柱洗脱并进入离子源时部分分解为CBZ。这意味着在Eslicbz的保留时间中，存在两个前体离子，Eslicbz在m/z 297.1227和m/z 237.1017时分解离子。这两者都将穿过质谱仪，并在碰撞电池中产生各自的产物离子。
当将反式CBZDIOH注入离子源时，观察到类似的崩溃。
将反式CBZDIOH溶液输注到离子源中（图2B）产生了反式CBZDIOH M/Z 271.1075的预期前体离子，并且与CBZEP和CBZMono Hydroxy一致。输注实验是在正常离子源条件下进行的，并且在离子源中没有碎裂能量。
这两个输注实验证明可以在离子源中进行一些转化。发生转化的地方，分析物通过保留时间很好地分开。但是，单羟基代谢产物尚未测试，这增加了分析CBZ及其代谢产物的复杂性。因此，需要强大的色谱和对前体和产物离子数据的仔细解释，以确保选择正确的分析物并准确测量。
由于缺乏单羟基标准，使用废水样品来确定所有代谢产物的保留时间。该仪器的出色灵敏度和分辨率有助于将样品直接注入液相色谱质谱系统的能力，仅在分析之前对样品进行过滤，这仅限于几个样品。这将确保由于样本清理或浓度步骤中的恢复差而不会错过分析物。

使用开发的LC方法对废水样品的分析确定了多个峰，其中某些样品的过渡M/z 253.10→210.0921。253.10的3个主要产品离子为M/z 180.0814、182.0971和210.0921。从CBZEP标准中，观察到M/z 254.0812的另一个产品离子。图3B证明了M/Z 253.10→210.0921的特异性较少，尤其是CBZEP，但对于单羟基代谢物而言，这将是选择的离子。在反式CBZDIOH之前洗脱的峰（7.6分钟）被认为是葡萄糖醛酸代谢物。通过仔细的选择，确定了环氧化物的更具体的过渡（M/z 253.10→182.0971），该氧化物进一步将其与干扰区分开。使用改进的色谱法和特定过渡为CBZEP提供了良好的定量方法。未知的“ A”具有前体M/z 255.1133，并且没有10,11-二氢-10-羟基甲状腺果质体，因为两者都有不同的保留时间。TMS2实验的隔离窗口更改为2 m/z，从而消除了此干扰。
从CBZEP标准中，转换253.10→182.0971和253.10→254.0812是特异性的，并且使用这些产品离子CBZEP与其他分析物分开（图3 C和E）。M/z 254.0812的产物离子是不寻常的，因为它的分子量高于前体离子。适合C15H12NO3+分子公式的精确质量。这可以通过向二羟基的环氧环开口和NH2的损失来解释（图4B）。
图4. CBZEP产物离子（253.10→254.0809）的实验和理论模式的比较和CBZEP 13C同位素的提取的离子色谱图
= 254.1002。

有必要确认产品离子（M/z 254.0812）不是CBZEP的13C同位素。CBZEP的理论13C同位素在插图中（图4C）。比较CBZEP的实验离子和理论同位素模式证实这是CBZEP的产物离子（M/z 254.0810），而不是13C同位素（M/z 254.1005）。使用具有较小分辨率的仪器CBZEP的产品离子（M/z 254.0821）无法使用，因为不可能将其与13C同位素区分开（M/z 254.1015）
HRMS非常敏感，但是，鲁棒色谱对于复杂的混合物仍然至关重要，并且仍必须对HRMS数据进行解释以防止干扰和假阳性。

致谢

本研究中使用的LCMS/MS系统由Nopills Project资助，这是跨国领土合作计划InterReg IVB NWE的欧盟资助的一部分；这项支持得到了极大的认可。这项工作还部分由PHOS4YOU项目，通过赠款NWE292的InterReg VB西北欧洲计划（2014-2020）资助。我还要感谢我的博士主管Moyra McNaughtan博士和John Maclachlan博士。

参考

1. Sniffer，2010年。分析沉积物和污泥中选定药物和滥用药物的方法论，可在以下网址提供：http：//www.sniffer.org.uk/files/9113/4183/7992/7992/er09_final_e-final_e-version_e-version_final_final_final_final_final_final_final_final_final_3may101.pdffffin。
2. Roberts，J.B.，2017年。通过LCMS/MS对废水中药物和化学代谢产物的确定和鉴定。博士学位论文，格拉斯哥喀里多尼亚大学。
https://ethos.bl.uk/orderdetails.do?uin=uk.bl.ethos.726806
3. Miao，X.-S。和Metcalfe，C.D.，2003年。使用液相色谱 - 电喷雾串联质谱法测定水溶液样品中卡马西平及其代谢产物。分析化学，75（15），pp.3731–3738。可在以下网址获得：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14572037。
4. Bahlmann，A.，Brack，W.，Schneider，R.J。和Krauss，M.，2014年。废水中的卡马西平及其代谢物：在德国和葡萄牙发生的分析陷阱和发生。水研究，第57页，第101-114页。＃