色谱法不仅仅是分离

2020年9月14日

作者：詹姆斯·霍本（James Hogbin）和林（Charis Lam）代表高级化学开发公司（Inc.）

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开发色谱方法不仅仅是分离化合物。精心设计的方法补充了方法开发团队的最终目标，并帮助回答研究和业务问题。要采用这种方法，开发过程必须从一开始就考虑到这些目标并遵循预定义的计划。

介绍

如果色谱法是将混合物分离为组件的科学，那么方法开发就是将分离转换为有用目的的技巧。科学家很少会为此而分betway88体育官网开化合物。色谱为项目或研究目标服务，开发的方法必须与这些目标保持一致。
因此，组件的分离不是分析方法的唯一要求。根据项目的不同，其他需求可能包括长期的方法稳定性，简单的方法转移，高收益和纯度，用于制备量表，对所有杂质和降解产物的检测等等。有组织的色谱学家从一开始就确定了这些需求，并设计了一个实现分离和其他方法目标的方法开发计划。
三层过程（图1）是该计划[1,2]的基础：
1.定义项目目的
2.匹配参数与目的
3.验证性能
此过程可确保从一开始就设计完整的方法。
图1：方法开发计划应包括（i）项目目的的定义，（ii）使用项目目的选择和优化参数，以及（iii）绩效验证。

定义项目目的

如所讨论的，分析方法的最终目的不是分离化合物。分离是一个重要的直接目的，但它实现了更高的目标。
通常，早期护理人色谱仪无法解决项目中的多层用途。他们开始只了解浅薄的理解，与同事进行短暂的对话后跳入实验室：
问题：“我需要在这种混合物中分开三种杂质。”
答：“我可以为你做。”
不幸的是，这种方法导致了不断的修订周期。这三种杂质将分开，只有色谱学家才能得知还有其他预期的杂质，然后将它们分开，只是了解到正交高性能液相色谱/质谱法（HPLC/MS）筛选方法是从一开始就最合适的选项。
要弄清一种方法必须从一开始就必须满足的所有需求，请以彻底的问卷开始：
1.问题是否完全理解？
2.问正确的问题吗？
3.手头上的所有事实吗？
这些问题强化了该项目应得到充分理解。不仅在表面上 - 这是问题的第一次介绍中经常出现的东西 - 而且还详细介绍了为什么需要进行分离，分开的内容，将要使用信息以及它们如何使用的所有细节要使用它。
4.客户是否问过正确的问题？
5.他们有所有事实吗？
一种有用的色谱方法有助于人们做出决策。受影响的人列表可能很长：整个团队可以使用开发的方法，甚至越来越多的人可能会依靠方法结果来进行工作。因此，了解整个用户链是至关重要的。例如，如果最终用户将是只有HPLC设备的合同房屋，那么开发90分钟的超高性能液相色谱（UHPLC）梯度几乎没有目的。连锁店中的每个人都可能了解问题的部分，但是通常，没有人能理解整个图片。要完整了解该项目，请与多个利益相关者交谈。
6.应该采取什么方法？
根据到目前为止所学到的知识，从第一原则设计了一种方法。考虑预期的复合结构，并在计算机工具中使用以预测溶解度，LOGP，LOGD，PKA和降解途径。从逻辑上计划的方法将节省时间，并从一开始就指导色谱师沿正确的方向。
7.结果如何报告？
8.报告了哪些结果？
9.一旦报告结果会发生什么？
知道为什么开发方法有助于色谱仪来确定应如何报告结果。尽管许多组织使用标准报告模板，但对于每个项目，这些模板仍应进行审查。项目目标最重要的信息是什么？那是报道吗？提供的信息足以使下游团队做出决定，还是必须进一步询问数据？
10.这些条件将长期使用？
11.这是工作的终结还是一个长期项目？
方法应该经受时间的考验。即使方法生命周期是简短的，麻烦的方法产生了意外的问题，因此最好通过彻底的测试来确保鲁棒性。
12.适合目的吗？
13.这个GMP，GLP，开发还是不知道？
无论方法开发背后的原因是什么，必须始终遵守开发过程中最高标准。这减少了内部或外部承包商的方法转移中的下游问题。

匹配参数与目的

如果答案没有为方法开发提供信息，那么回答这些问题将是一个空的练习。要将确定的目的变成具体方法参数，请定义方法规格并选择筛选条件。
方法规格清楚地指出，在任何工作开始之前，项目都需要实现的目标。这里分享的问题将有助于确定该项目的广泛类别：准备性扩展，定量方法开发或调查研究。
每个类别都有不同的要求。例如，制备量表与纯粹与感兴趣的化合物的分离有关。目的是在合理的时间内获得高恢复和纯度，而其他因素（例如解决个体峰）也可以牺牲。但是，什么构成“合理”的时间或恢复？这些应在规格中定义，具体取决于已经收集的信息。
为了开发定量方法，必须将基准设置为定量质量。如果需要重量重量百分比，则必须提供纯标准。可能有关于定量准确性的政府或第三方指南，或者可能需要根据项目的目的再次确定这些准则。
最后，对于调查研究（例如，强制退化研究），有关样品的详细信息将有助于设计方法开发计划。最好从单个组合样本而不是多个样本中使用。对于样品较少，更简单地跟踪多个色谱条件的化合物。考虑可能形成什么杂质，以及如何确定该方法是否检测到所有杂质。切勿假设单个UV/VIS检测器，无论是二极管阵列还是单波长，都会捕获所有化合物。具有多个探测器的系统（例如，光散射，电晕荷气溶胶，荧光和MS）更彻底。
设置规格后，开始实验工作。为了进行有效的筛选和优化，请使用前开发中收集的信息选择用于筛选的参数范围。
图2显示了影响分析方法性能的所有参数。应该对所有这些做出明智的决定；根据猜测或过去的习惯选择要进行调查的参数只会延长方法开发时间。
图2：许多参数会影响最终色谱法的成功。
例如，应根据分析物理化特性选择要筛选的溶剂和pH。通常，实验数据不容易获得，因此可以使用软件工具来帮助。商业软件工具提供了有用的预测，例如溶解度，LOGP，LOGD和PKA。
图3显示了一个这样的工具，即ACD/方法选择套件。pH（左）绘制了化合物的预测logD。基于这一点，还图（右）也图形为主离子形式。主要物种随pH的变化而变化，但重要的一点是在该曲线的高原上选择一个洗脱pH。否则，pH的微小转变将极大地影响该方法。
图3：预测软件可用于可视化logD（左）和显性离子形式（右）的变化。
举一个例子，列的选择取决于复合属性和项目注意事项。复合特性显然会影响固定相选择：非极性分析物应在C8，C18或类似的固定相分开；二醇，氨基，氰基，苯基或C4的低到中等性分析物；以及二氧化硅，氨基或氰基的中度至高极性分析物。但是也应考虑项目目的。开发后方法会发生什么？如果将其传输到只有HPLC的实验室，则在UHPLC列上开发该方法将是毫无意义的，甚至适得其反。如果该方法要长期使用，则理想情况下，原始列类型应在整个持续时间内可用。即使使用相同的列类型，色谱柱包装中的批处理变化也会影响分离。在最终确定方法条件之前，最好在多批次上运行分离以监视分辨率和特异性变化。
检测器选择是另一个受分析物理化特性和其他要求影响的因素。显然，应基于预期的化合物特性，例如，化合物是否呈紫外线剂，选择检测器。（还应考虑洗脱属性，因为它们可能会影响复合属性。例如，使用溶剂ph的吸光度光谱转移。）但是项目目的也进入方程式：如果测量降解剂很重要，应该对化合物的了解可能有所了解降解以及这可能如何影响不同检测器中的测量信号。使用多个检测器启动开发项目通常是一个好主意。这样可以确保检测到所有化合物并因此可以达到质量平衡。
图2中所有参数的逐因素解释超出了本文的范围。然而，如这些示例所示，有效的方法开发是必要的。

优化参数

筛选的选择参数范围只是实验工作的开始。方法开发的一种理性方法探索了选定的参数空间，以找到最佳和健壮的区域。
图4显示了标准筛选计划。色谱仪并没有一次优化所有变量，而是在波浪中处理它们 - 一种更有效，更易于管理的方法。
在第一波中，筛选了列，缓冲区和溶剂。此步骤应该缩小选择范围，尽管它不需要留下一个选择。如果两个或多个列对确定的规格执行，则可能值得将多列前进。
一旦选择了列，缓冲液和溶剂，可以优化梯度和温度。仿真工具可以在这里提供帮助。给定一些在不同梯度和温度下收集的色谱图，软件可以在参数空间上模拟色谱图并找到最佳分辨率的区域。
这个逐步的过程将使方法开发更加有效，但是经验丰富的色谱仪将对整个项目保持一定的看法。尽早采取的某些步骤将使方法更有可能通过以后的验证和风险评估。例如，早期开始使用检测极限样品。这将在工作中以一种永远不会符合规格的方法来标记任何具有敏感性的问题。
在优化结束时，方法开发团队应已解决一组完整的方法参数。

验证性能

通过有条不紊地接近发展前和开发，应将色谱仪置于验证的好地方 - 使用可能通过验证和鲁棒性测试的方法。
验证之前，评估强制降解结果（如果适用）并检查质量平衡。写下风险评估：一个生存文件，涉及最可能的失败点。该文档应定期审查和更新，尤其是在稳健性和方法转移练习的结果中。
然后移动验证该方法，检查：
1.样品浓度和注入量
2.分析波长选择
3.相对响应因子测定
4.分析解决方案稳定性
5.特异性，分辨率，线性，报告限制和检测限
6.定量方法
在验证过程中，借助合理的早期数据。在开发过程中会生成大量数据。如果开发实验的设计经过精心设计，并且所得数据得到正确处理，注释和存储，则可以用于回答验证问题。例如，开发数据可用于研究峰形变化或保留时间漂移，从而减少了所需的验证实验数量。
如果可以证明性能，那么方法开发项目就成功了。但是，只要使用一种方法，开发就永远不会真正结束。每当用例更改时 - 如果原材料发生变化，则可以改变合成途径，或者样品不同 - 重新评估该方法。