时间分辨电子显微镜的进步如何改善生物样品的成像?在罗莎琳德·富兰克林研究所研究发现的边缘

扫描透射电子显微镜(STEM)长期以来一直是物理和生命科学中理解材料结构的重要技术。在过去的十年中，STEM技术在无机材料和生物材料的研究中几乎分别取得了进展;然而，研究生命的新方法正在这些领域的重叠中出现。其中一项技术进步是利用电子进行高分辨率成像。

牛津郡哈维尔校区的罗莎琳德·富兰克林研究所(Rosalind Franklin Institute)致力于通过跨学科研究和技术开发改变生命科学，正在推动这一领域的研究，通过其相关成像主题构想和开发了一种用于成像生物材料的开创性STEM仪器。
Ruska是Franklin开发的三种仪器中的第一种，其独特设计可提供前所未有的空间和时间分辨率成像低温冷冻生物材料和液体生物样品。
罗莎琳德·富兰克林研究所的相关成像小组正在检查罗斯卡的安装情况。Emanuela Liberti博士、Chen Huang博士、Angus Kirkland教授(从左至右)。图片来源:Ryan Cowan。

脉冲照明前所未有的时间和空间分辨率

生物标本的结构损伤是目前限制STEM[1]空间和时间分辨率的主要因素。电子对生物物质的损害取决于辐照过程中传递给样品的能量(即电子剂量)。损伤的发生与显微镜的加速电压传递的初级电子能量有关。Ruska可以在从300千伏到40千伏的宽加速电压范围内工作，以允许在一次电子能量选择上具有最大的灵活性。
显微镜也有可变脉冲照明。在电子源处，快速光束消光器(或静电剂量调制器)以持续时间从µs到ms可调的“脉冲”将电子分布到样品上，每个脉冲中的电子数量也是可调的，从而可以精确控制剂量。这种调节照明的能力提高了空间和时间分辨率，因为样品是在短时间内成像的，而损伤是可控的。脉冲照明尤其有利于液体成像，在液体成像中，尽量减少损伤是避免光束驱动动力学的关键。
鲁斯卡也有静电光学子帧记录。该技术以可编程序列[3]将光束快速偏转到高速摄像机的不同区域。通过这种方式，记录过程只受到相机速度的部分限制，将时间分辨率提高到每秒数十万帧。

图1所示。典型的双校正扫描透射电子显微镜。Ruska改进了标准设计，由于高速静电消影器，一个安装在电子枪之后，一个安装在相机之前(未显示)。Ruska有用于常规STEM成像的环形探测器(这里只有一个)，但也有用于提高时间分辨率的高速摄像机。环形探测器将散射强度集成到环形的散射角范围内，而高速摄像机则收集整个散射角范围。

相位检索电子型图方法提高对比度

Ruska的光学像差校正是仪器提高空间分辨率以研究生物材料[4]的关键(图1)。尽管校正器通常用于研究无机材料的物理科学，但其在生物学中的应用受到限制。在Ruska中，透镜像差的硬件校正应用于透射(TEM)和扫描(STEM)光学元件。在TEM模式下，图像校正器通过物镜改善了样品的聚焦，从而在高空间频率下获得了更好的信息传递。然而，低频的传输仍然很差，这意味着很难在单个图像中识别生物结构。对于低温冷冻的样品或在液体中实现高对比度更加困难，因为周围的基片具有与样品相似的密度，进一步降低了图像质量。
解决方法是结合相位恢复成像技术来提高像差校正的分辨率。这些方法利用在信息传输与照明设置的变化，以提高在空间频率范围内的对比度。相位检索方法适用于瞬变电磁法和瞬变电磁法。Franklin在STEM中应用了一种相位检索方法，该方法是最近为物理科学(如电子型图)开发的，用于成像生物分子(如冷冻水合轮状病毒双层纳米颗粒)，与cryo-EM[5]相比，对比度更高。更高质量的图像可以减少目前在单粒子三维重建中实现原子分辨率所需的大量粒子和数据集。相位检索方法也不局限于小颗粒的均匀集合，但可以表征较大区域(1µm2)的异质标本，以发现分布或相互作用。
在STEM相位检索技术中，将一个收敛电子探针扫描整个样品以记录二维相干(干涉)电子衍射图阵列，然后将其输入到一个平面迭代引擎(ePIE)中，以恢复由电子束散射引起的物体出口波函数(图2)。ePIE是一种用于显微镜的计算方法，通过逆计算(所谓的“相位问题”)来解决物体函数的相位。在此相位恢复过程中传输的空间频率带宽取决于探头的收敛角，可以对其进行调整以获得较强的相位对比(图2)。
当Ruska在STEM模式下工作时，探头校正的好处来自于可用于成像的大范围会聚角，因为探头形成系统的聚焦得到了改善。例如，对于抗光束样品，亚埃尺寸的会聚探针提供横向原子分辨率和亚纳米深度分辨率。然而，小型探针具有极高的电子通量(比所需的高一万倍以上)，这将完全破坏生物材料。“富兰克林”号计划利用探针校正技术，利用稀疏扫描几何结构对生物材料进行高空间分辨率成像，以智能方式分配电子通量。稀疏扫描方法(扫描位置之间的间隔在空间和时间上以几何或随机顺序变化)已经被开发用于在液体中对无机材料进行成像，并且可以为生物学领域提供新的成像方法。为此，鲁斯卡配备了一个额外的随机扫描发生器。该技术可以改变扫描线圈的扫描模式，实现智能次采样像素扫描。
图2。用于生物分子成像的电子型图实验示意图。当电子探针扫描样品时，直接探测器收集相干束电子衍射图(CBED)。该4D STEM数据集被输入电子平面迭代引擎(ePIE)，用于恢复复杂物体和探针功能。

快速直接电子检测的最大时间分辨率

与快速消隐器一起，使Ruska成为时间分辨仪器的关键技术是快速直接电子检测。在过去的十年里，直接探测器彻底改变了电子显微镜。这些相机与传统传感器的区别在于它们提高了记录速度和探测器量子效率(DQE)。这些增强的能力转化为更好的信噪比，即使很少使用电子进行成像，这对生命和材料科学都有巨大的影响。其中一个例子是冷冻电镜的“分辨率革命”，其中蛋白质结构的成像现在可以在原子分辨率下使用直接检测和单粒子平均[9]。直接电子探测器的出现也革新了原位成像技术。在这里，记录速度对于捕获快速动态事件至关重要，而探测器的效率是必需的，因为需要低剂量以最小化电子束与介质的相互作用。
直接探测器是实现高时空分辨率生物成像的关键技术。Ruska将配备三个直接电子探测器(图1中的高速摄像机)。这些摄像机中的每一个在不同的加速电压和成像模式下表现最佳。最重要的是，这些探测器都有非常高的记录帧率，每秒数千张图像。摄像机也可以与消影器和扫描发生器同步，以实现对电子通量、照明速度和记录时间的最大控制。

液体电池技术

我们的最终目标是研究它们在自然环境中实时发生的生物过程。这意味着原位成像必须跨越大范围的空间和时间分辨率。Ruska将实现从微尺度到分子尺度的空间分辨率和从毫秒到微秒的时间分辨率，同时将样品保持在液体环境中。显微镜将容纳一个新设计的液体细胞支架，可以将样品溶液捕获在电子透明膜之间，由氮化硅或石墨烯箔制成，保护样品免受显微镜真空环境的影响(图3)。这项技术将使研究范围广泛的生物系统成为可能，包括药物-靶标相互作用，聚合物组装和蛋白质动力学。此外，Ruska还配备了新的双能量色散x射线探测器，用于化学制图。该技术能够就地收集化学数据，将显微镜的能力扩展到液体生物的分析光谱。将液体细胞成像与Ruska的高空间、时间和化学分辨率能力相结合，将允许在4D中访问以前隐藏的快速动态事件。对生命系统中发挥作用的分子动力学的更好理解可以被视为提高我们对所有生物/医学系统理解的基本基石之一。
图3。液体电池TEM支架示意图。LCTEM支架可以容纳由硅衬底和电子透明Si3Nx窗口或石墨烯网格制成的芯片。在这两种技术中，溶液中的样品被封装并与显微镜柱中的超高真空密封。
富兰克林项目由英国工程与物理科学研究委员会(EPSRC)资助。该研究所是一个独立的组织，由英国研究与创新，十所英国大学和钻石光源成立，其中心枢纽位于哈维尔科学与创新园区。欢迎有关合作研究的查询。
有关鲁斯卡电子显微镜的更多信息，请联系:emanuela.liberti@rfi.ac.uk

参考文献

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3.里德，b.w.;穆加达姆，a.a.;布鲁姆，r.s.;Park, s.t.;蒙特罗萨，m.a.;普赖斯，p.m.;巴尔，c.m.;布里格斯，s.a.;Hattar K; McKeown, J. T.; Masiel, D. J., Electrostatic subframing and compressive-sensing video in transmission electron microscopy, Structural Dynamics 2019, 6 054303
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6.少女，a.m.;李建军，张建军，一种改进的衍射成像相位检索算法，光学学报，2009,29(1):1256-1262。
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8.MacLaren i;麦格雷戈，t.a.;艾伦，c.s.;柯克兰，A. I.，《探测器——扫描透射电子显微镜正在进行的革命，以及为什么这对材料表征很重要》。应用物理快报，2020,8(11):991 - 901。
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