CaptureSMB高效亲和纯化的单克隆抗体

一种新颖的双列逆流色谱过程用于捕获的单克隆抗体(mab)阐明细胞培养的收获。过程特性改进的性能在生产力方面,缓冲消费,产品浓度和产能利用率比传统批色谱法。在这个案例研究中,优势更加明显随着加载流速度增加。由于其自然循环,CaptureSMB过程非常适合与常规分批的集成以及连续处理。

介绍
亲和色谱固定相成本最大的耗材成本的司机下游加工的生物制剂。然而,在传统的批量色谱中,固定相并没有充分利用列加载的动态行为:提要加载一个s形内部产物浓度方面形式的列结果等温线和传质效果。这导致的早期突破和损失之前感兴趣的蛋白质完整的树脂能力被利用。通常30 - 50%的最大容量,即静态绑定能力,在批处理色谱未使用。加载后,列是清洗,产品恢复和列是清洗。从而也以前利用树脂的分数还没有打扫。自清洗是一个决定性的司机树脂降解很明显,可以节省大量成本通过提高产能利用率的色谱步骤。
在twin-column CaptureSMB过程,这是通过加载一个列,直到大量的产品了,但是同时捕捉突破相互关联的第二列(见图1)。
图1所示。突破曲线的示意图(BTC)(出口浓度洗脱体积)的列与饲料,直接加载。EV1 EVX:洗脱体积相应的进料浓度1% (1% DBC),和X %进料浓度,分别为(X % DBC)。区域对应的最大数量的产品,可以加载在单个列的批处理过程中,在产品突破。两个相互关联的列,A + B和D区域对应的产品绑定在上游和下游列列,分别列时加载EVX。A + B + C区域对应的静态能力。
中概述的过程包括以下步骤和原理图如图2所示:
IC -互联阶段:两列连接在系列和加载通过upstream-column发生:第一列的突破是在第二列捕获。一旦上游列被加载到产能利用率高,停止加载和缓冲通过两列泵串联,以冲洗的物质从上游到下游的列。
B -批处理阶段:断开和上游前面列的列是洗,筛选了恢复产品,清洗和re-equilibrated。并行,此前采取的列的突破上游列是继续被装载在一个较低的流量。
B阶段是紧随其后的是另一个集成电路阶段,前面列放在上游位置和加载平衡列放置在下游位置和列在系列再次加载。集成电路阶段然后跟着另一个B运行阶段,如上所述,只是列顺序相反。这就完成了一个周期和CaptureSMB过程可以进行尽可能多的周期。
图2。的示意图说明twin-column CaptureSMB过程。
性能参数定义
CaptureSMB和批处理过程比较基于性能参数的定义如下。
纯度P被定义为产品的面积比峰值和总峰面积百分比的分析给出了色谱和[%]。这个纯洁的定义通常是应用,在计算纯度对产品相关杂质如聚合或碎片。分析色谱的区域提取产品分数:

对宿主细胞蛋白质等杂质(HCP)或DNA纯度是表示数量的杂质/数量的产品,例如[ng HCP / mg马伯]或[ppm HCP],通常由ELISA或其他荧光化验。
制程良率Y被定义为产品质量恢复的比率产品池mpool和产品质量提供通过提要mfeed,在一个周期内。CaptureSMB色谱,收益率是衡量后启动循环,即过程已经启动和紫外线概要文件时不改变了从循环周期(启动后循环):

质量平衡关闭mb被定义为产品质量之比离开系统城市包括所有进入系统的出口流和产品质量通过饲料在同一时间段(mfeed)。在批处理和CaptureSMB色谱法(后启动循环)质量平衡关闭通常被称为一个周期:

负载L之间的比率被定义为产品质量在饲料和床总额Vcol (CaptureSMB包括所有列),测量同一时期内(通常为一个周期):

生产力推动被定义为产品质量包含在产品的比例池,mpool,一个周期,循环时间tcycle Vcol固定相总量:

公元前缓冲消费被定义为缓冲体积的比值Vbuff和大众消费产品池中获得mpool,测量同一时期内(通常为一个周期):

产能利用率铜被定义为负荷的比值L和静态容量Qsat,这对应于最大结合容量。

单克隆抗体捕获的案例研究
单克隆抗体(IgG1滴定度1.2毫克/毫升)被从澄清使用CaptureSMB收获细胞培养过程[1]。流程运行在Contichrom®从ChromaCon Lab-10设备,使用ChromIQ®操作软件。
两列10厘米的长度和内径0.5厘米挤满了AmsphereTM智威汤逊- 203蛋白(JSR生命科学),1列卷(CV)为2.0毫升。一个紫外探测器安装在每一列的出口。
恢复和再生协议已经决定通过单一列批捕获运行之前,报告在表1。缓冲是20毫米磷酸盐,150毫米氯化钠,pH值7.5;磷酸盐缓冲B是20毫米,1 m氯化钠,pH值7.5;缓冲Na-Cit C是50毫米,pH值3.2;和缓冲D为0.1 M氢氧化钠。流量是1毫升/分钟(300厘米/ h)除CIP一步这是0.33毫升/分钟(100厘米/ h)。
表1。恢复和再生批色谱的协议
一步缓冲区的数量列卷(简历)
洗1一2
洗2 B 5
洗3一5
洗脱C 5
CIP 7.5 D / h(100厘米)
平衡1 C 2
平衡2一3

产品池使用分析蛋白质浓度测定色谱法(波罗斯岛A20列,2.1毫米x 30 mm,生活技术),总尺寸排阻色谱法测定的内容(TSK-Gel G3000SWXL, 7.8毫米x 300毫米,Tosoh),和HCP值测定使用CHO-HCP酶联免疫试剂盒(# F550, Cygnustechnologies)和DNA含量被荧光量化(Quant-iTTM PicoGreen®dsDNA装备,生活技术)。
CaptureSMB操作参数测定的突破曲线阐明收获与单个列(10厘米长度,给水流量的300厘米/ h)。的ChromIQ®的操作软件Contichrom®设备平台允许完全自动化的CaptureSMB操作参数的确定。
从本质上讲,计算包括的马伯的决心是包含在上游和下游列,分别在加载量的依赖两个相互联系的列。在当前情况下,列被加载到70%的进料浓度达到在上游的列的列出口(由离线部分突破曲线的分析)。由于B所需的时间是固定的恢复和再生协议,和IC的进料流量(最大所需饲料流量应该选择,在这种情况下300厘米/ h),其余的参数QB(批处理阶段的饲料流量)和抽搐(互联阶段持续时间)可以确定。QB增加安全系数的80%占树脂降解。
在上述过程类比,确定操作参数也为150厘米/ h的最大进料流速,450厘米/ h和600厘米/ h。
紫外线信号记录在每一列的出口是如图3所示(底部)运行的最大进料流量300厘米/ h。断开连接的阶段(61毫升长度)和相互关联的阶段(41毫升长度)清晰可辨。列加载期间,迅速增加的达到高原紫外线信号能够被观察到的价值。高原紫外线信号对应于流经的杂质。在相互联系的阶段从上游列马伯的突破是可见杂质高原水平上升。紫外线的同时,增加配置文件是不可见的紫外线的下游列,这表明整个马伯,突破是吸附在下游列中。
过程控制的基础上,突破UV-signals[2]是非常简单的实现和验证了twin-column CaptureSMB。
参考流程,批处理色谱运行以同样的树脂体积(0.5 x 20厘米L身份证列)进行了加载相应的90% 1%突破价值[3],加载流速度150厘米/ h、300厘米/ h、450厘米/ h和600厘米/ h,分别,同样的恢复和再生协议(表1)。
的结果的最大进料流率150厘米/小时到600厘米/ h显示批量色谱和CaptureSMB可比的纯度。(批处理运行:2.0 -3.0%,总量7000 - 12的000 ng HCP / mg马伯,1.0 - -5.0 ng马伯DNA /毫克。CaptureSMB运行:1.5 -2.5%,总量5000 - 12000 ng HCP /毫克马伯,2.0 - -4.0 ng DNA / mg mAb)。
图4显示了生产率的函数CaptureSMB的流量和批处理过程。twin-column捕捉SMB的生产力比批量的生产力单柱捕捉任何饲料流量。这是由于两个原因:首先,CaptureSMB过程的负载更大(DBC列加载远远超出1%)。其次,恢复和再生协议进行了快一倍,自恢复和再生过程中床层高度只是床层高度的一半(10厘米)的批处理参考运行(20厘米)。它可以进一步观察到生产率差异对批处理色谱流率的增加而增加(图4)。
这可以归因于一个扩大的突破曲线随着流量增加的结果影响CaptureSMB比上批色谱法从早些时候在CaptureSMB材料,突破由于进料流率的增加可以同样在第二列。
因此减负荷要求获得一个可以接受的收益率(最好是> 90%)要小得多CaptureSMB批色谱相比,导致更戏剧性的减少产能利用率(图4 b)。
自负载降低产能利用率(减少)随着饲料CaptureSMB流速不太相关,缓冲消费仍几乎恒定CaptureSMB虽然增加批色谱法(图5)。
结论
CaptureSMB过程提供显著的性能优势相比,批处理色谱法。CaptureSMB调查马伯捕获情况下的生产力是大35%,而平均产能利用率提高了25%,转化为树脂成本降低25%。缓冲消费平均降低了20%。CaptureSMB对批处理色谱法的优点是resin-dependent。初步研究表明,树脂与更广泛的突破曲线(即较大的粒子)和更大的静态能力的优势CaptureSMB可以超过50%的生产力增长,40%树脂降低成本和节省40%的缓冲进料流率高(600厘米/ h)。
由于其自然循环CaptureSMB非常适合结合连续灌注等上游生产发酵。连续生产设备的大小(泵、列)通常可以减少至少一个数量级。
引用
1。Muller-Spath,助教莫妮卡;鲍尔,丹尼尔;Roel Lievrouw;Lissens Geert;Strohlein,圭多;Bavand,迈克尔;Morbidelli,马西莫;,增加产能利用率在蛋白质色谱法。Biopharm国际,2013年。 26(10): p. 33-38.
2。Warikoo, V。,et al .,集成连续生产的重组治疗性蛋白质。生物技术和生物工程,2012。109(12):3018 - 3029页。
3所示。Mahajan E。答:乔治,b,使用半连续色谱法提高亲和色谱法树脂效率。色谱法杂志》,2012年。1227:154 - 162页。