蛋白质纯化工作流开发使用Bio-Rad NGC™色谱系统

高纯度蛋白是一种常见的生化和结构的研究要求。通常的做法是将重组表达的affinity-tagged版本感兴趣的蛋白质。然而,这是并不总是一个可行的选择。这里我们讨论蛋白质纯化工作流开发未加标签的蛋白质和引入新的性能指标的方法,纯度的区别(PQD)。

高纯度蛋白样品是必要的应用程序从蛋白质结构测定和生化特性描述抗体生产。一个标准的净化方法是使用亲和标签如hexahistidine (6 x组氨酸)或glutathione-S-transferase (GST)标记。这些标签增加吞吐量和蛋白纯化工作流程的效率,协议往往容易获得或由制造商提供的。
亲和标签并不总是可行的选择。一些蛋白质不稳定或不活跃的标记或者需要转译后的修改,不允许重组表达。在这些情况下,研究者常常满足于低纯度的蛋白质而不是详尽探索净化选项,自净化优化过程可以时间和劳动密集型当没有特定列树脂或缓冲条件是由一个亲和标签。
净化标记或无标记蛋白质,最佳净化工作流包括柱、pH值、梯度和洗脱缓冲(% B)优化为每个净化步骤(图1)。在这里,我们表明,Bio-Rad NGC中压层析系统,配备列开关阀,采样泵,缓冲混合阀,和ChromLab™软件侦察功能,允许我们列的过程自动化,pH值,% B最优化。使用未加标签的,发色的蛋白质,舞蹈者紫色,我们说明小列化学或pH值变化剧烈影响蛋白质绑定和洗脱缓冲液pH值的变化或梯度可以极大地影响筛选了蛋白质的纯度。
我们的发现水泥的重要性列,pH值,和缓冲球探在开发净化工作流和说明Bio-Rad NGC色谱系统和ChromLab软件促进这一进程,使无标记蛋白质的高纯度可以达到每一个研究者。

图1所示。蛋白质纯化工作流侦察。
材料和方法
蛋白表达
2.0的kanamycin-resistant舞蹈者紫色表达载体(DNA)转化为HB101 E。杆菌使用标准的热休克方法。一个殖民地被选为10毫升磅补充和卡那霉素(磅/菅直人)一夜之间成长在37°C。细胞颗粒状使用埃普多夫5804离心机(转子A-4-44) 4000转2880 (RCF) 10分钟,在10毫升新鲜resuspended磅/菅直人和接种1 L(磅/菅直人。文化是生长在一套瓶37°C到200 rpm。舞蹈者紫色表达诱导时文化达成OD600 0.4,通过添加IPTG的最终浓度0.1毫米。一夜之间感应后,细胞被离心收获与转子Sorvall sa - 600 10000转14500 (RCF) 10分钟,卡那霉素是50μg /毫升的浓度用于液体和固相的增长。

细胞溶菌作用
细胞颗粒在20毫升resuspended B-Per(皮尔斯猫# 78243)裂解缓冲补充20μl 1毫克/毫升DNase MgCl2我和200μl 1米。溶菌产物被离心澄清在10000 rpm (14500 RCF) 10分钟。

列侦察
Bio-Rad NGC发现™系统用于所有色谱法。三1毫升阴离子交换色谱法列,远见™Nuvia™Q, Bio-Scale™迷你UNOsphere™Q和Bio-Scale™迷你Macro-Prep®高Q,和一个5毫升Bio-Scale™迷你CHT™II型色谱柱连接到不同的位置在NGC列开关阀。离子交换的球探在ChromLab软件生成方法。使用缓冲混合阀,股票的解决方案Q1盐酸(0.2米),Q2 (0.2 M三),(水)第三季度和第四季度(4 M氯化钠)被混合生成缓冲区(50毫米三pH值7.5)和缓冲B(50毫米三pH值7.5和1 M氯化钠)。侦察员特性被用来侦察四列列的不同位置开关阀。阐明溶菌产物与水稀释3倍和1毫升的稀释溶解产物直接使用样本泵注入到列。
列是平衡5列卷(CV)和缓冲a大约1毫升的示例应用于列。列然后用5毫升的缓冲和蛋白质与20简历筛选了线性梯度从0 - 50%其次是A 10 CV 50%。线性梯度列之后和re-equilibrated 5 CV 100% B洗,紧随其后的是10简历缓冲洗。所有净化步骤进行1毫升/分钟的流量。分数从每个运行通过sds - page分析。

pH值侦察
一旦远见Nuvia问列被选为第一列,ChromLab软件侦察功能将pH值球探选项。绑定是评估在pH值为7.0,7.5,8.0和8.5。1毫升的稀释溶解产物直接注入到远见Nuvia问列在每个pH值在使用样品泵的方法。大约0.2毫升分数每次运行和sds - page分析收集的。

% B侦察
pH值7.5被选中后,侦察功能被用来优化% B。10简历线性梯度洗脱阶段的部分被选为% B侦察(20、30、40、50最终% B)。1毫升的稀释溶解产物直接注入到远见Nuvia问列在每个使用样本泵pH值。0.2毫升分数每次运行和sds - page分析收集的。

十、陶瓷羟基磷灰石层析
汇集远见Nuvia问分数是双重的用水稀释。缓冲系统Bio-Rad NGC发现系统改为磷酸磷酸氢钠(Q1 = 0.2米,Q2 = 0.2米磷酸氢二钠)和10毫升的样品被加载到一个5毫升Bio-Scale迷你CHT II型柱预平衡与50 mM磷酸钠pH值7。蛋白质与20简历筛选了线性梯度从0 - 50% B和收集1毫升分数。

丰富™秒70色谱法
汇集CHT分数集中到200μl(~ 20倍)使用微孔5 k集中器。样本然后通过静态循环注入到一个丰富秒70尺寸排除列预平衡磷酸钠50毫米和150毫米生理盐水(15% B)。蛋白质筛选了使用权力平等主义的流1.25 CV。1毫升分数被sds - page收集和分析。

sds - page分析
色谱侦察,样本通过sds - page分析任何kD™标准™TGX没有污点™聚丙烯酰胺凝胶。凝胶运行在300 mA /凝胶为30分钟,然后立即成像使用ChemiDoc™成像系统。

纯度的计算
为个人侦察数据运行ChromLab评价选项卡中打开软件(图2)。峰值集成了280和525海里的痕迹。分数的表选项卡包含相对峰面积和峰面积是导入到Microsoft Excel。纯度(PQ)为每个波长计算相对面积(%)除以收集到的体积(ml)。舞蹈者的纯度不同紫色(PQDPP)计算每个分数PQ525——PQ280和画柱状图。每个球探的经营类型的柱状图(柱、pH值和% B)画在一起进行分析。

PQD方程:
PQ =相对面积(%)/收集体积(毫升)
PQPOI - PQcontaminant = PQD
PQD > 0:更多感兴趣的蛋白质(POI)污染物
比POI PQD < 0:更多的污染物
PQD = 0: POI在等量存在污染物

图2。列侦察。一个,

舞蹈者紫色绑定%计算
个人专栏球探评价选项卡中打开ChromLab软件。峰集成使用默认设置在525 nm跟踪执行。切换到手动集成选项卡,每次运行的高峰列表是减少到三个山峰(B) flowthrough洗脱,100%以下的开始和结束卷:flowthrough 0.98 - -7.39 ml,洗脱22.17 - -31.82毫升,带45.49 - -52.41毫升。
结果
列侦察识别最佳树脂对蛋白质绑定
未加标签的舞蹈者紫色在大肠杆菌表达重组。舞蹈者紫色有预测的等电点(pI)的选择裂解缓冲pH值6.65和7.5,使阴离子交换一个优秀的我们的净化流程的第一步。Bio-Rad有许多不同的阴离子交换树脂各种珠大小和化学反应。我们选择一个大的珠子大小可以容纳快流速与我们的高粘性原油溶解产物样本。

三1毫升阴离子交换色谱法列,远见Nuvia Q, Bio-Scale迷你UNOsphere Q和Bio-Scale迷你Macro-Prep高Q,附加到不同的港口NGC列开关阀。生成一个方法在ChromLab软件指定相同的缓冲条件和流量三列。选择列变量ChromLab软件侦察功能llowed我们评估相同的样本和色谱条件下蛋白结合。自动三分的队列是通过使用NGC样本泵直接注入到列在示例应用程序阶段,通过自动分配洗脱侦察到适当的列运行期间收集到的分数。
虽然这三种树脂阴离子交换树脂、显著区别的能力结合舞蹈者紫色的观察,一大部分原因要归咎于珠化学反应的差异。看着相对面积百分比(表1),舞蹈者紫色绑定最有效的远见Nuvia问树脂,有效减少Bio-Scale迷你UNOsphere问树脂,并没有结合Bio-Scale迷你Macro-Prep高Q树脂(图2)。计算纯度不同舞蹈者紫色(PQDPP)和sds - page数据支持这样的结论:远见Nuvia问是最好的树脂选择舞蹈者紫色净化工作流程的第一步。

酸碱侦察识别最佳的绑定
列树脂最好的选择,我们下一个优化方法的缓冲博士自pH影响蛋白质的电离作用地位,这是一个特别是离子交换色谱法的关键因素。利用混合缓冲阀和pH球探选项ChromLab软件侦察功能,我们测试了绑定的舞蹈者紫色远见Nuvia问树脂在pH值范围从7.0 - -8.5自动队列的四分。虽然舞蹈者紫色绑定到远见Nuvia问树脂在每一个测试的pH值、pH值更高更多的污染物绑定到列(图3)。减少污染物,选择缓冲pH值为7.5。
% B侦察识别最佳浓度和梯度洗脱缓冲
一旦一个最佳pH值建立了舞蹈者的紫色绑定,我们优化洗脱步骤单独舞蹈者紫色从残留的污染物。使用% B球探选项ChromLab软件,我们检测10简历洗脱梯度从最后的20 - 50% % B在四个独立的运行。最浅的缓冲区梯度,0 - 20% B,导致最优浓缩的舞蹈者紫色(图4 a、B)。一些高和低分子量污染物仍然存在,主要我们添加额外的纯化步骤工作流程(图4 B)。

消除剩余污染物使用Bio-Scale迷你CHT II型羟磷灰石陶瓷树脂
在起始列侦察阶段,我们也评估了舞蹈者的紫色绑定到混合模式离子交换树脂Bio-Scale迷你CHT II型陶瓷羟基磷灰石。舞蹈者紫色显示高亲和树脂和明显,污染物的洗脱剖面不同于那些被发现在我们的远见Nuvia Q洗脱。因此我们选择Bio-Scale迷你CHT II型树脂净化我们的第二个步骤,把剩余的污染物从远见Nuvia Q洗脱。优化远见Nuvia Q-Bio-Scale迷你CHT II型列组合产生高度纯舞蹈者的紫色所说明的没有污染的乐队在任何kD标准TGX没有污点聚丙烯酰胺凝胶(图5)。
缓冲交换和样品抛光使用尺寸排阻色谱法
对于某些应用程序,如结晶学,最后洗脱缓冲组合是至关重要的。同样,许多应用程序需要最终的样品缓冲批次的成分是相同的。使用梯度洗脱时,然而,确切的缓冲池的组成洗脱分数通常是未知的。尺寸排阻色谱(SEC)是一个很好的
方法以确保一致的缓冲区组成从预科到预科,因为分离不是依赖于缓冲梯度。SEC也消除了低丰度污染物,proteolyzed片段,和总物种,确保最终蛋白质的高纯度和均匀性。我们因此合并的最终大小排斥一步纯化协议使用丰富交会70列,有一个高压力的限制,允许更高的流量和减少所需的时间这个步骤相比,基于碳水化合物的珠子(图5)。
图5。最终净化流程未加标签的舞蹈者紫色任何kD标准TGX没有污点sds - page凝胶。20μl样本加载。溶菌产物(左)和Nuvia问flowthrough稀释1:20。洗脱(E)所示为Nuvia Q, CHT II型陶瓷羟基磷灰石,并丰富70列。舞蹈者紫色分子量:26.4 kD。
讨论
这项研究表明,未加标签的蛋白质可以净化高同质性当净化选择足够了。详尽的探索通常是不切实际的,因为确定理想的净化工作流程需要优化的多个变量,如列树脂、pH值,和% B,在每一步。这意味着需要大量的运行在每个净化步骤确定收益率蛋白质的纯化工作流程所需的纯度。传统上,这一过程需要单独设置和程序运行每个测试列,pH值,% B条件。ChromLab软件,然而,允许我们加速这个乏味的过程自动化。
ChromLab软件可以通过编程来执行几个顺序运行。它控制NGC系统的不同组件,如NGC样本泵直接注入到列,pH值的缓冲区混合阀,让球探和% B列开关阀,可以自动切换到五个不同的列。这允许我们侦察四离子交换柱无需用户干预相同的设置和仪器编程时间作为一个传统的运行要求。在类似的方式,我们可以探讨多个pH值条件而不需要让每个测试和滴定个人缓冲区博士最后,自动化% B球探允许我们改善蛋白质的最终纯度。
我们的数据表明,列侦察是至关重要的,即使特定的树脂类型,如阴离子交换树脂,已被选择。我们这里,树脂为类似的设计使用(在本例中阴离子交换)可以显示出截然不同的绑定效率对于一个给定的蛋白质。尽管远见Nuvia Q和Bio-Sclae迷你UNOsphere问树脂都是强阴离子交换树脂与三甲胺官能团,舞蹈者只紫色绑定远见Nuvia问树脂。这很可能是因为珠化学和大小的差异。
净化工作流程发展的第二个挑战是评估选定的方法产生最好的结果。传统上,基于A280色谱跟踪,跟踪存在的蛋白质洗脱列在色谱运行,分数由sds - page选择进行分析。然后选择方法(1)产生大量蛋白质的利息,(2)收益率一些污染的蛋白质,和(3)洗提感兴趣的蛋白体积小。这里我们介绍第三个因素,纯度的区别(PQD),可以通知方法开发感兴趣的蛋白质和污染物吸收不同波长的光。
大多数蛋白质含有色氨酸,因此吸收光的波长280 nm。显色蛋白质、荧光标记的蛋白质或metal-bound hemoproteins等蛋白质,以及污染物如DNA,吸收其他波长的光。使用NGC发现多波长检测系统,我们可以分辨舞蹈者的洗脱图紫色(525海里)从污染的洗脱图蛋白质(280海里)。因为吸光度在色谱峰下的面积成正比的蛋白质筛选了高峰,我们能够计算舞蹈者的纯度不同紫色。
ChromLab软件的集成特性峰值计算洗脱峰下的面积,以及相对峰面积,这是一个衡量多少百分比的总蛋白感兴趣的洗提加载在一个特定的峰值(图2)。因为我们想要确定哪种方法产生了舞蹈者的最高浓度紫色,我们正常的相对峰面积除以体积。我们称之为值计算纯度,舞蹈者紫色(PQ525)和血清总蛋白(PQ280)。
制备色谱的目标,然而,不仅仅是获得高产的蛋白质;我们的目标是获得一个纯蛋白质的高收益。纯度由sds - page传统的定性评估。减去纯度的污染物(PQ280)感兴趣的蛋白质的纯度(PQ525),我们计算了不同纯度的舞蹈者紫色(PQDPP)。
使用这些计算,PQD零表明,污染物和感兴趣的蛋白质在等量存在。PQD > 0表示感兴趣的蛋白质丰富,和PQD < 0表明污染物富集。PQDs可以跨分数产生PQD绘制直方图。PQD直方图为不同的球探可以覆盖条件识别方法PQD超过最小的数最高的分数(图2 d、3 c、4 c)。
PQD分析,然而,目的是补充,而不是替代,sds - page。尽管高PQD表示感兴趣的蛋白质的浓缩,它并不排除污染的存在蛋白质。PQD直方图的pH值球探建议没有改善净化当pH值从8.0提高到7.5(图3 c)。sds - page分析,然而,清楚地表明,污染物与舞蹈者紫色co-elute pH值8.0(图3 b)。
PQD直方图也不处理污染物的性质。我们最初一轮列球探包括混合模式Bio-Scale迷你CHT II型羟磷灰石陶瓷树脂。我们发现类似程度舞蹈者紫色是纯化使用远见Nuvia Q和Bio-Scale迷你CHT II型树脂,但不同污染洗脱蛋白被发现。我们是为舞蹈者能够确定一个最佳的第二列紫色净化侦察跑在我们最初的列。
这不仅强调了需要分析最后的纯洁感兴趣的蛋白质也杂质存在于每一列球探来看,这些信息可以通知的树脂选择后续纯化步骤。使用Bio-Rad预制任何kD标准TGX没有污点聚丙烯酰胺凝胶我们能够解决和分析蛋白质样品在不到30分钟,这允许我们从大量的分数描述洗脱模式在很短的时间。
这里描述的sds - page和PQD分析可以应用于列,pH值,和% B侦察,以及额外的侦查措施,如优化的有机相,反相色谱法或硫酸铵浓度为疏水作用色谱法。这个舞蹈者紫色的案例研究说明了,NGC system-mediated自动化这些侦察过程允许详尽探索净化选项。结合ChromLab软件的直观的编程特性和预加载净化模板,NGC系统允许我们净化一个未加标签的蛋白质纯度的前提下。
B-PER是一个商标的热费希尔科学。