推进有效的多糖分析

研究者们越来越关注生物分子的至关重要的类:部分聚糖。研究虽然低于其他主要构建块的生活——蛋白质、脂类和核酸——复杂和多样化的聚糖是生活中必不可少的,无处不在的生物从古生菌对人类[1]。最近glycoscience的进步使人们对聚糖和他们的角色有了新的了解关键代谢、结构和物理组件在生物结构。glycoengineering已经建立的潜力,也许最重要的是,在治疗性抗体的发展。
本文概述了聚糖临床扮演的角色的例子,多糖的挑战的分析,总结了工具阐明其复杂的结构,并给出了数据比较传统与新兴技术的高分辨率质工作流离子流动(HRIM)光谱。

聚糖,Glycoengineering和药物开发

糖生物学的知识拓展,巨大的重要性在生命科学的许多分支的功能聚糖[2]包括肿瘤[3]等关键领域,免疫学[4],[5]传染病被阐明。此外,多糖分析的发展伴随着增加能力控制特定生物分子的糖基化。称为glycoengineering,这个过程涉及操纵糖基化模式,通过特定的糖基转移酶的遗传调制或通过化学处理后glycoconjugates生物合成[6]。
糖基化的差异已经被证明能够影响治疗性单克隆抗体(mAb)活动在很多方面(7、8)。作为一个主要的例子,减少或避免岩藻糖的单糖从Fc域聚糖(也称为defucosylation)一再显示(ADCC)增加依赖抗体的细胞毒性。Defucosylating抗体结构导致更高的激活自然杀伤(NK)以及其他免疫细胞。这反过来会导致更大的ADCC治疗马伯绑定,包括癌细胞(12、13)。基因泰克(美国加州旧金山南部)应用这一策略开发Gazyva (obinutuzumab)成功
70亿美元的大片CD20-targeting马伯,利妥昔单抗(美罗华)。病人接受Gazyva显示更大深度的缓解和无进展生存相比增加接受利妥昔单抗[9]。
此外,糖基化变异的病人可以与治疗结果。为了优化治疗和临床试验结果(如患者分层),有能力识别是至关重要的糖基化概要文件以高通量的方式。
关于疫苗研发,另一个例子的临床影响聚糖包括hiv - 1膜蛋白,这是丰富的装饰着多糖结构帮助病毒逃避免疫系统的识别。这种所谓的“多糖盾牌”是一个活跃的研究领域,作为潜在的疫苗研发的目标和广泛中和抗体生产[10]。同样,COVID-19流行带来了关注SARS-CoV-2峰值蛋白质糖基化在病毒感染中扮演的角色和在治疗发展(11、12)。建立在广泛中和抗体研究艾滋病毒[13],研究人员也将类似的方法应用到冠状病毒[14]。

多糖分析的挑战

利用glycoengineering和增强知识的潜在糖基化模式,研究人员越来越感兴趣利用更好的工具和方法快速、准确地确定多糖结构。然而,尽管令人印象深刻的进步,多糖分析仍是一个挑战,很大程度上是由于聚糖本身的性质。
争议的主要结构性挑战是聚糖是一个结构上最多样化的生物分子家庭[2]。尽管大多数哺乳动物聚糖在九个单糖单元,由这些单体可以通过许多不同的糖苷联系,包括分支的方式[15]。此外,聚糖可能从一个单糖许多。集体,可能多糖结构的数量迅速扩张与每个额外的单体和分支。估计hexasaccharide有,总的来说,~ 1012种可能的多糖结构,尽管他们可能并非所有发生在自然[16]。
此外,多糖组装模板驱动的不像DNA, RNA和蛋白质的生物合成。相反,聚糖通过交错网络是由内质网和高尔基体的糖基转移酶作用。因此,不同的多糖结构可以发生在相同的糖基化位置,生成生物分子相同的除了聚糖(即改变)。分布的改变对于一个给定的glycoconjugate也受到改变糖基转移酶的表达变化。
重要的是,许多单糖组成聚糖同分异构体的——葡萄糖,半乳糖和甘露糖'的例子。这意味着许多不同的多糖结构可以有相同的质量,费用,和物理性质,但在功能和识别差别很大。这些复杂的异构材料的分离和识别可以极其耗费时间和资源密集型的。

多糖分析工作流的状态

如上所述,多糖结构本质上是复杂的和异构。多糖分析的首选技术一直是质谱(MS),它提供了所需的分辨率和灵敏度阐明特定多糖结构和改变与生物材料(17、18)。然而,高度相似的聚糖之间实现有意义的决议在同一个样品,分离技术之前需要女士的分析。
在实践层面,LC高度相似的生物分子的分离-多聚糖等经常需要延长运行时间,创造一个潜在的瓶颈分析工作流。即使长时间运行的,一些聚糖行为同样LC coelution不可避免,而复杂化,甚至阻止完整结构赋值[19]。
所以,虽然质仍多糖分析的标准工作流程,有迫切需要加快技术更好的分辨能力。
最近,离子流动高分辨率质谱(HRIM-MS)基于结构无损的离子操纵(SLIM)已经成为一种很有前途的在多糖分离策略分析[20]。不同于液相色谱,MOBILion HRIM系统分离电离分子在气相。系统使用印刷电路板(pcb),见图1,在恒压室维护(2 - 4托)。多氯联苯的一系列的射频(RF),直流(DC)和行波电极印在他们提供一个离子通道的分析物沿着异常漫长蜿蜒的路径遍历。推动离子的电场也阻止他们惊人的表面移动时,因此防止任何损失。根据行波的速度,离子“冲浪”,是不分开的,或者他们接受足够的与在场的气体分子碰撞,他们翻身行波的峰值,并发生分离。
在HRIM,与其他离子迁移技术,离子的迁移时间是由其质荷比和其大小和形状。离子沿分离路径驱动;惰性缓冲气体的碰撞使他们在一定程度上与它们的大小成正比。离子分离路径的长度是至关重要的实现所需的高分离度获得足够的分辨率聚糖与挑战性的结构多样性。MOBILion第一HRIM产品离子路13米(42英尺)。独特的蜿蜒的路径设计印刷电路板允许13 m离子路径适合一个公文包大小的设备允许无与伦比的异构结构的分离。
HRIM设置很简单,因为它发生在接近理想条件下的气相。不需要优化列,流速,或液体组件与LC。此外,HRIM达到快速分离与数据收集在毫秒到秒。已经写了很多关于最先进HRIM方法提高分辨能力通过扩大路径长[21]当结合(HRIM-MS,图2)女士为无缝的分离提供了巨大潜力聚糖结构决心在生物医学和临床研究(22、23)。

HRIM-MS在实践中

最近的工作复杂碳水化合物研究中心(CCRC)佐治亚大学,雅典,格鲁吉亚,美国已经证明HRIM-MS的性能。实验相比,这种下一代离子迁移技术,优化质协议[24]。
试验装置在使用CCRC MOBILion HRIM仪器与安捷伦6545四极飞行时间(Q-ToF)。Permethylated N-glycans释放胎球蛋白和RNaseB分析180分钟逆转阶段nanoflow质/女士,典型的传统的LC N-glycan分析工作流。相同的使用HRIM-MS多糖种类进行分析。在2分钟,所有聚糖识别使用共鉴定了180分钟的LC分离使用HRIM-MS工作流。这节省90倍时间允许,例如,一个三个月信用证分析压缩到一天分析。此外,HRIM-MS分析解析的结构同分异构体biantennary disialylated无法解决的复杂多糖与LC(图3 b, G5)。
能够快速运行数百个样品可以建立聚糖异质性的“正常范围”。这一优势允许更大的洞察的行为聚糖广泛的疾病,在一个时间框架兼容生物制药发展的快节奏。

展望未来

多糖的分析,或作者,科学家阐明生物分子的特定的糖基化模式,已成为生物医学研究的一betway88体育官网个重要方面,药物开发和生物制药质量控制。与传统方法相比,HRIM擅长易用性generalisability多个分析物类的一个方法分辨率,和速度的分析。这些属性允许研究人员解决多糖结构的复杂性和异质性在时间尺度,使高通量分析。这里讨论的HRIM分析比信用证分析速度快了近100倍,但仅仅是开始。快速采样——持续发展的主题——可能速度分析次额外的数量级。

引用

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免责声明:MOBILion是商业化的苗条的独家许可技术的目的。HRIM目的是仅供研究使用。不是为了诊断程序。
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*兰斯井乔治亚研究联盟杰出的研究员,生物化学和分子生物学教授综合生命科学主任,主任热费舍尔在Glycoproteomics任命卓越中心的CCRC佐治亚大学。可以通过lwells@ccrc.uga.edu与他联系。
* *迈克尔Tiemeyer杰出研究生物化学和分子生物学教授联合热费舍尔大学任命为Glycoproteomics卓越中心的格鲁吉亚,和复杂的碳水化合物联合研究中心,佐治亚大学。可以通过mtiemeyer@ccrc.uga.edu与他联系。
MOBILion系统还想承认Jeffrey琼脂博士,副教授,东北大学和凯利l .苦恼莫泽博士实验室MOBILion系统公司业务经理和应用科学家投入这项工作。